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模拟群体感应合作行为的基因回路的效果验证(7)

时间:2017-02-07 20:22来源:毕业论文
2.26 酶切产物的连接 割胶回收的目的片段经过电泳验证后,使用T4 DNA连接酶连接。DNA连接酶可以催化双链DNA平头末端或黏性末端相邻核酸的5-PO4和3-OH连接反



2.26 酶切产物的连接
割胶回收的目的片段经过电泳验证后,使用T4 DNA连接酶连接。DNA连接酶可以催化双链DNA平头末端或黏性末端相邻核酸的5′-PO4和3′-OH连接反应。本实验中酶切后的产物具有黏性末端,因此按黏性末端连接来设计反应体系。反应体系的组分见表2.4:
表2.4 T4连接酶反应体系组分
反应物    体积/μL
pEGFP-C1+    5.0
pPopCtrl1    5.0
10×T4 DNALigase Buffer    2.0
T4 DNA Ligase    1.5
ddH2O    7.0
酶切反应条件:22℃,10min,然后65℃,10min灭活。

2.27 目的质粒的转化
将连接好的质粒pPop-galac转化到Top10F细菌。由于正确的连接产物可以表达卡那霉素抗性基因和LacZα,所以导入了正确连接质粒的细菌可以在含有卡那霉素并涂有IPTG和X-Gal的LB平板上生长,而且产生蓝色菌落。转化的具体步骤如下:
(1)取1mLA600nm约0.5-0.6的菌液到1.5mL的微量离心管中。
(2)4000rpm离心4-5min。彻底去除上清,再加0.1mL的预冷的SSCS(一步法制备感受态细胞溶液)溶液轻轻悬浮菌体。    
(3)加入100pg-10ng用于转化的DNA。
(4)混匀DNA和细胞,冰浴30min,然后在42℃放置90s,再在冰上放置15-20min。
(5)加0.8mL的LB液体培养基到离心管中,而后在37℃,200rpm下培养1小时。
(6)4000rpm离心5min,吸掉0.8mL上清液,用剩余的培养基使细胞重悬。
(7)将剩余细胞涂布于相应抗性的平板上培养,观察结果。

2.28 目的质粒的验证
在用T4 DNA连接酶连接质粒时,会出现多种连接情况。首先对选取的菌落扩菌,进行蓝白斑实验验证,确定细菌含有LacZ基因与抗卡那霉素基因, Top10F缺失LacZ段。通过蓝白斑对刚转化的工程菌的蓝白斑验证方案如表2.5:
表2.5刚转化后工程菌的蓝白斑验证
编号    细菌    碳源与诱导剂    实验时间
a    Top10F    乳糖    
24小时
b    T    乳糖    
c    T    乳糖IPTG    
然后观察菌落颜色。
根据酶的单一性,选取NcoI酶对目的质粒连接方式进行验证。NcoI酶的反应体系如表2.6:
表2.6NcoI酶的反应体系
反应物    体积/μL
DNA    4.0
    见下一页
续表:    
超纯水    13.5
缓冲液    2.0
NcoI酶    0.5
酶切反应条件:22℃,10min,然后65℃,10min灭活。

2.29 工程菌株的生长曲线
有氧、TBK条件下,以OD600为纵轴,以生长时间T/h为横坐标的生长曲线的绘制方法:将8个克隆经中的JT4接种于LB培养基培养过夜后,按0.1%的接种量分别转接至10ml含卡那霉素TBK培养体系的阳性管和对照管中。对照管不加乳糖,同时作3个平行试验。设置方案如表2.7:
表2.7有氧、TBK条件下生长曲线测定方案
管号    培养基/TBK    OD600
1    空白对照    
2    空白对照    
3    空白对照    
4    乳糖    
5    乳糖    
6    乳糖    
7    先加IPTG,生长到17小时加入乳糖    
8    先加IPTG,生长到17小时加入乳糖     模拟群体感应合作行为的基因回路的效果验证(7):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_2606.html
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