纤文素酶(Cellulase)为一种含有多个组分的复合型酶类,它能够催化纤文素分解,使之分解成为寡糖或多糖[3],并最终形成葡萄糖供真菌利用。自然界中很多真菌都能够产生纤文素酶。据有关文献资料记载,纤文素酶的种类非常多,而且来源不同的纤文素酶的组分及其占比都有着很大的不同[4]。该酶在人类的生产生活当中扮演着十分重要的角色,比如说:在乙醇发酵方面,可作为酒曲微生物发酵乙醇的原料;在动物饲料生产加工工业中,一般饲料中含有丰富的纤文素,利用纤文素酶处理饲料,可促进家禽的吸收消化。当然,在造纸业、轻工业(如纺织工业)等行业中纤文素酶也得到广泛的应用[5]。
总之,纤文素酶应用非常广泛,已经牢固的与人们生活的方方面面结合在一起。而针对我国秸秆生产数量庞大的情况,培育出具有高纤文素酶活力的菌株并进行生物燃料乙醇制造,是我们现在急需认真对待的事情。
1 材料与方法
1.1实验设备
酶标仪(美谷分子仪器有限公司);
恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司);
高速离心机(赛默飞世尔科技公司);
干式恒温器(杭州奥盛仪器有限公司);
倒置式生物显微镜(荧光)(Motic AE31);
凝胶成像系统(杭州朗基科学仪器有限公司);
MP21001电子天平(上海横平科学仪器有限公司);
电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);
PCR扩增仪(杭州BIOER技术公司)
超净工作台;高压蒸汽灭菌锅;量筒;烧杯;容量瓶;锥形瓶;塑料锥形瓶;移液管;恒温水浴锅;制冰机;电磁炉;搪瓷缸;微波炉;20μL、200μL和1000μL型号的移液枪;接种针;酒精灯;铝箔纸;环氧乙烷灭菌的塑料培养皿;玻璃培养皿;96孔板;摇床;2mL离心管;玻璃棒;冰箱;冻存管;铁锅;75%酒精棉球;电泳仪;剪刀;镊子;计时器;标签纸;记号笔;粉碎机等
1.2 实验试剂和药品
1.2.1 试剂
3,5—二硝基水杨酸(DNS)。配制方法:先在500mL蒸馏水中准确加入91 g酒石酸钾钠溶并充分搅拌溶解。然后在上述溶液中按照顺序分别加入3.15 g DNS,20 g NaOH,该过程要持续加热、搅拌才能使之充分溶解,接着再往溶液中加入2.5 g重蒸酚, 2.5 g无水Na2SO3,同样不断地加热、搅拌使之充分溶解,最后自然冷却,并定容至1000mL,将之贮放在棕色试剂瓶当中(避光处理),放置7天之后才能使用。
pH4.6的 0.2 mol/L HAc-NaAc缓冲液。配制方法:取甲溶液5.1 mL: 乙溶液4.9 mL充分混匀即可(甲溶液为0.2 mol/L HAc溶液,配制方法:取12 mL HAc溶液,用蒸馏水稀释至1L;乙溶液为0.2 mol/L NaAc溶液,配制方法:取27.22 g NaAc•3 H2O,将之溶于1L蒸馏水中即可)。
1% 羧甲基纤文素钠(CMC-Na)溶液。配制方法:准确称取1 g CMC-Na,之后将之加入到100 mL的HAc-NaNc缓冲液中,因为羧甲基纤文素钠具有难溶性质,因此要水浴加热并使之使溶解。待冷却后定容至100 mL。
1 mg/mL标准葡萄糖溶液。配制方法:准确称取0.5 g葡萄糖,并加入蒸馏水使之溶解,最后准确定容至100 mL。
1.2.2 药品
琼脂条、羧甲基纤文素钠(CMC-Na)、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、 硫酸铵((NH4)2SO4)、七水合硫酸镁(MgSO4•7H2O)、乙酸(CH3COOH)、次 氯酸钠(NaClO)、SDS、氯化苄、乙醇、氯仿、异丙醇以上试剂购自国药集团化学试剂有限公司;刚果红购自上海试剂三厂;三水合乙酸钠(CH3COONa•3H2O)购自徐州试剂二厂;葡萄糖(C6H12O6)购自天津市大茂化学试剂厂;氯化钠(NaCl)购自上海苏懿化学试剂有限公司。 纤维素酶产生真菌分离纯化与鉴定(2):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_32255.html