(注:不要使加样孔有气泡,若有气泡,用细枪头轻轻捣出。)
7.剪1长条封口膜,用移液枪先后移取7.5µl ddH2O、1.5µl loading buffer和6µlDNA样品溶液,用枪头混合均匀后,加入样品孔内,留出最左边的加样孔加2µl Marker。
(注:loading buffer/(ddH2O+ loading buffer+DNA样品)=1/10,DNA样品一般不少于6µl。加样时枪头要伸到液面以下,靠近加样孔,连续缓慢的加入样品。ddH2O、loading buffer、DNA样品、Marker冰浴融化。)
8.连通电源,电压为3~6V/cm(长度以两个电极之间的距离计算),红色为正极,黑色为负极,切记DNA样品由负极往正极泳动。
(注:一般实验电压为120V,靠近加样孔一端为负极即黑色。)
9.根据指示剂泳动的位置,判断是否终止电泳。一般待溴酚蓝的蓝色条带电泳到凝胶的3/4处时即可终止电泳。
10.戴上手套,取出凝胶,凝胶成像仪观察电泳带及位置,并与Marker比较。
(3)SSCS一步法制备感受态细胞(包含转化)。具体操作如下:
1.扩菌:取5ml LB液体培养基(with kan)放入到已灭菌的试管中,接种一个107单菌落,将试管放入37℃、250rpm的恒温摇床中培养。
2.取1ml上步扩好菌液(A600nm约0.35~0.4)到1.5ml的微量离心管中。
(注:取200µl菌液于新的96孔板中,用酶标仪测量A600nm,如菌液未到0.35,则继续培养,之后再去200µl菌液再测,直到菌液处于0.35~0.4间。)
3.4,000rpm离心5min,彻底去除上清液,再加0.1ml的预冷(4℃)的SSCS溶液轻轻悬浮菌液。
4.加入1µl质粒用于转化DNA。
5.混匀DNA和细胞且在冰上放置30min,然后在42℃的离心管加热器中放置90s,再在冰上放置15~20min。
(注:事先将离心管加热器调至42℃。)
6.加0.8ml的LB液体培养基(with kan)到离心管中而后在37℃,250rpm下培养1h。
7.将细胞(离心管中液体取100µl)涂布于相应抗性(Kanr+ Cmr )的平板上,37℃培养0.5h后倒置培养约18~30h。
2.2.4 CFU数据测定
(1) 扩菌与接种培养
先将所需菌株WT,1408在LB(含卡那霉素)液体培养基中进行37℃,250r/min扩菌培养15h,再按1:1000的比例将其接种到有抗性的TBK(含卡那霉素)培养基中30℃,250r/min 培养12h,同时将107’在LB(含卡那霉素与氯霉素)液体培养基中进行37℃,250r/min扩菌培养15h。
(2) 制备上清液
12h 1mM-IPTG TBK培养基上清液:9mL1mM-IPTG TBK对细菌进行12h的培养后,9000rpm/min离心10min,弃菌体沉淀,上清液用细菌滤器过滤除菌或加入氯霉素后作为培养基待用。
(3) CFU测定
将107’菌液按1:100的比例分别加入上清液中30℃,250r/min进行培养,从0时刻起,每隔1小时取样,将取得的样品进行适当稀释涂布到含氯霉素和卡那霉素的LB固体培养基,37℃恒温培养12~18h,计数。
2.2.5酶标仪法测定生长曲线
(1) 扩菌与接种培养
方法同2.2.4
(2) 制备上清液
方法同2.2.4
(3)酶标仪法测定OD600
将WT、1408、107’菌液按1:100的比例分别接入上清液中,摇匀,将接种过的上清液200uL按顺序加入96孔板中,加入50uL矿物油密封,运行酶标仪,测定其OD600(生长曲线)。
酶标仪运行步骤:
1. 双击桌面上的Gen5软件图标,出现操作界面 ;
2. 在操作界面上选择新建实验方案 ;
3. 选择操作的板型:96 WELL PLATE ;
4. 设定检测方法为:吸光度A600nm ;
5. 设定振板时间:20s ;
6. 设定操作温度:30℃ ;
7. 设定开始动力学: pPopctrl质粒中Tn5转座子的插入对AHL信号分子生成的影响(6):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_4090.html