Prescription of reagent

30%单体贮备液 30 g丙烯酰胺，0.8 g N，N-甲叉丙烯酰胺，溶解后加水定容至100 mL，过滤，4℃保存

4×分离胶缓冲液 18.17 g Tris，0.4 g SDS，加水溶解后用1 M HCI调整pH至8.8，定容至100 mL

4℃保存

4×浓缩胶缓冲液 6.06 g Tris，0.4 g SDS，加水溶解后用1 M HCl调整pH至6.8，定容至100 mL

4℃保存

10%过硫酸铵 0.1 g过硫酸铵，1 mL水，现配现用

10%TEMED 0.1 mL TEMED，0.9 mL水，4℃保存

蛋白提取液 50 Mm Tris-HCl，0.01 M 2-巯基乙醇，pH 8.0，4℃保存

4×样品缓冲液 0.6g Tris，1 SDS，12.5 mL甘油，加水溶解后用1 M HCl调整pH至8.0，再加0.05 g溴酚蓝,2.5 mL -巯基乙醇，定容至50mL，分装至-20℃保存

电极缓冲液 3.03 g Tris，1.0g SDS，14.4g甘氨酸，加水溶解后用1 M HCl调整pH至8.3，定容至1000 mL

固定液 40%甲醇，10%乙酸，50%水

R250染色液 125 mL甲醇，50 mL乙酸，0.5 g考马斯亮蓝R250，溶解一夜后定容至500 mL

脱色液 100 mL乙酸，100 mL甲醇，800 mL水混匀

12.5% SDS-PAGE分离胶 15 mL分离胶缓冲液，25mL Arc-Bis，19 mL蒸馏水，1 mL 10%过硫酸铵，20 uL TEMED

5% DSD-PAGE浓缩胶 1.5 mL浓缩胶缓冲液，2.5 mL Arc-Bis，5 mL蒸馏水，0.5 mL10%过硫酸铵，20 L TEMED

1.2.2 蛋白的提取和电泳样品的准备

（1）从每粒大豆种子上刮取0.1g粉末，置于1.5 mL离心管中，加500L蛋白提取液置于37℃摇床振荡2h；

（2）振荡好后在4 ℃、12000 rpm条件下离心20 min，取上清液；

（3）吸取5μL相同浓度的样品按4:1比例加入样品缓冲液；

（4）样品充分涡旋混匀并煮沸3～5 min备用。

1.2.3 SDS-PAGE电泳

    十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳采用的是不连续垂直凝胶电泳，凝胶厚度为1mm，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12.5%。

（1）组装凝胶模具，按照说明书组装好灌胶模具，配置1.5%琼脂凝胶，封胶。对于Bio-Rad的微型凝胶电泳系统，在螺丝拧紧之前必须确保凝胶玻璃板和底部胶条紧密相接，防止细微不匹配导致凝胶泄露；

（2）配置分离胶，加入过硫酸铵和TEMED后，轻轻搅拌使其混匀（过硫酸铵现配现用，操作时戴手套）；

（3）小心将分离胶溶液灌入模具中（分离胶溶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm处）；