大量科学研究表明几丁质酶与植物防御系统相关，这种酶是催化水解β-1,4-糖苷键的一种酶，是植物重要的一种病程相关蛋白。而高等植物本身不含几丁质，当其受到外界刺激时，几丁质酶会在植物体内迅速积累，从而提高植物的抗病能力。

本课题组在早期的研究中已发现在不同抗性品种的甘薯中几丁质酶的活性有显著不同[2]。因此，本实验对其基因进行了大量研究，通过基因库（GenBank）找到一批几丁质酶的类似序列，通过比对分析其几丁质酶蛋白保守区域，得到2个几丁质酶基因，以两不同黑斑病抗性品种——南京92（高抗黑斑病）和烟台252（高感黑斑病）块根为材料，对其中一个几丁质酶基因18136进行了克隆及测序和实时荧光定量PCR，以研究其基因序列的异同以及两基因表达量之间的差异。通过分子生物学和生物信息学处理分析其结构和功能，以期为后续对该基因进行表达载体构建并转化至感病品种，获得优质抗性品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1 供试材料

本实验所使用的两种甘薯材料分别为“高抗黑斑病”品种—南京92和“高感黑斑病”品种—烟台252，均由徐州市农业科学院提供。

1.1.2 试剂及耗材

实验试剂包括LB固体培养基（北京奥博星生物技术有限公司）、SOC肉汤（江莱生物有限公司）、50ⅹTAE溶液（北京索莱宝生物技术有限公司）、反转录试剂盒（江苏溥博生物科技有限公司）、引物（上海捷瑞生物工程有限公司）、Phusion超保真PCR Master Mix（New England BaiLabs）、pGEM-T载体（普洛麦格生物技术有限公司）、SYBR Premix Ex Taq （Tli RNaseH Plus）（Takara 中国）；

实验中所使用的其余试剂盒包括RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒、超薄DNA产物纯化试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和植物基因组DNA提取试剂盒均自天根生化技术有限公司购买；

同时本实验室提供所有实验需使用的其它材料包括大肠杆菌、蓝白斑平板、GoldenView、100bp DNA Marker、6ⅹDNA loading Buffer、移液器、枪头、离心管、研钵、培养皿和液氮。

1.1.3 仪器

VD-650型沪净净化桌上式洁净工作台（上海苏净实业有限公司）、TGL-18000CR高速台式冷冻离心机离心机（上海安亭科学仪器厂）、DTC-PCR仪（西安天隆科技有限公司）、QPCR仪、GN110-3恒温混匀仪（苏州吉米诺仪器有限公司）、DK-S24型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）、JB-1B加热恒温磁力搅拌器（上海雷磁）、全自动凝胶成像仪（上海领成生物科技有限公司）、DYY-6C电泳仪以及电泳槽（北京六一仪器厂）、Nanodrop 2000C紫外分光光度计（赛诺菲世尔生物科技有限公司）、雪花制冰机、立式高压蒸汽灭菌锅。

1.2 实验试剂的配置

电泳液：将50ⅹTAE按1 ：49稀释为1ⅹTAE；

琼脂糖凝胶：称取琼脂糖加入到1ⅹTAE中使其终浓度控制在1%-1.5%，微波加热沸腾2-3次后，待其降温至65℃之后加入2-4μL GoldenView 混匀，倒入安好制胶板和梳齿的制胶槽中，自然冷却；

Ampicillin（100 mg/mL）：称量1g Ampicillin溶于10mL 灭菌水中，用0.22μm 滤膜过滤除菌后分装，-20℃保存；

IPTG（24 mg/mL）：称取0.24 g IPTG 溶于10mL 灭菌水中，用0.22μm 滤膜过滤除菌后分装，-20℃保存；

X-Gal：吸取X-Gal储液（50 mg/mL）1mL 溶于 1.5 mL 二甲基甲酰胺（DMF）中，混匀后分装，-20℃避光保存；

LB固体培养基：称取 LB 固体培养基粉末32g，倒入1L 水中，在电磁锅上煮沸2-3次后调整pH为7.0，121℃ 灭菌21 min；灭菌完成后稍冷却，倒平板（约20个）； 甘薯几丁质酶18136基因cDNA的克隆及序列分析(2):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_43199.html