1.3.4.2 最佳三元菌混合比例的确定
选取酵母菌、霉菌、芽孢菌以及乳酸菌作为三元菌菌种。将种子菌悬液按照最佳二元菌混菌和第三种产酯酶菌4:0、4:1、4:2、4:3、4:4、0:4的比例配制成混合菌液，将种子菌悬液按照最佳二元菌混菌和乳酸菌4:0、4:1、4:2、4:3、4:4的比例配制成混合菌液。将配制好的混合菌液按照4％的接种量接种于100 mL发酵培养基上，30℃、135 r／min条件下连续培养3-5 d，测其酯化酶活力，酶活力最高的混菌比例为最佳混菌比例。
1.3.4.3 最佳混菌发酵接种量的确定
选择最佳的多元菌株混合比例配制成复合菌悬液，将复合菌悬液按照2％、4％、6％ 、8％ 的接种量分别接种于100 mL发酵培养基中，30℃ 、135 r／min条件下连续培养3-5 d，测其酯化酶活力，酶活力最高的接种量为最佳接种量。
1.3.4.4 最佳混菌发酵初始pH值的确定
选择最佳的多元菌株混合比例配制成复合菌悬液，并将复合菌悬液按照最佳接种量分别接种到pH值为3、4、5、6、7的100 mL基础培养基上，30℃、135 r／min 条件下连续培养3-5 d，测其酯化酶活力，酶活力最高的pH值为其最佳初始pH值。
1.3.4.5 最佳混菌发酵生长温度的确定
选择最佳的多元菌株混合比例配制复合菌悬液，将配制好的复合菌悬液按照最佳接种量接种到最适初始pH值的培养基上，分别置于27℃、30℃、33℃、36℃温度梯度下，连续培养3-5 d，测其酯化酶活力，酶活力最高的温度为其最佳生长温度。
1.4 多元菌混合发酵条件的优化     
多元菌混合发酵条件的优化在单因素最佳水平基础上，以接种量、发酵温度、初始pH值为影响因素，设计正交试验表（见表4），进行3因素3水平的正交试验。
1.5 酯化酶活力的测定[15]
1.5.1 粗酶液的制备
取适量经摇床培养好的发酵培养基于离心管中，4℃、5000 r／rain离心15 min得上清液即为粗酶液，并放入4℃冰箱中保存。
1.5.2 酯化酶活力测定
将10 mL环己烷、6.25 mL己酸、3.25 mL乙醇、1.17 g无水硫酸钠以及0.2 mL酶液置于100 mL三角瓶中，36℃密闭培养24 h后取上清液0.5 mL于50 mL三角瓶中，加入5 mL蒸馏水，2滴酚酞，用0.05 mol/L的氢氧化钠滴定至出现微红色，测定己酸的消耗量。
酶活力单位定义：在测定条件下1 min消耗1 μmol己酸所需要的酶量为1个酶活力单位。
2．结果与分析
2.1 酯化酶的分离与筛选
2.1.1 酯化酶芽孢菌的分离与筛选
 
图1 产化酯酶芽孢菌产生的透明圈情况

表1 产酯化酶芽孢菌产生透明圈的情况
菌株编号    透明圈直径
（R/ mm）    菌落直径
（r/mm）    比值R/r
(平均值)
芽1    12    16    15    7    12    10    1.516
SPM1    12    14    8    9    10    5    1.444
SPM2-1    7    8    6    4    5    3    1.783
SPM2-2    8    7    8    5    4    5    1.533
SPM3-1    12    6    8    10    4    6    1.344
SPM3-2    15    9    12    11    7    8    1.383
SPh1    －    －    －    －    －    －    － 高产酯化酶复合菌剂的研制+文献综述(4):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_5549.html