2 材料与方法

2. 1 实验材料

供试水稻品种为成熟早、品质优良，增产潜力大、适应性广、稳产性好、容易脱粒、好栽培的常规粳稻“镇稻99”和粳型常规旱稻“洛稻998”。种子贮藏在15℃条件下保存备用。

2. 2实验处理

培养皿的处理：将36个培养皿洗净放入灭菌锅121℃灭菌20分钟，取出培养皿放进烘箱烘干，后取出培养皿待冷却后垫两层滤纸备用。实验分为六组（0,1,2,3,4,5），分别是水势为0,-0.1MPa,-0.2MPa,-0.4MPa,-0.6MPa,-0.8MPa[9]，在培养皿上贴上标签，例如镇稻第一组则为ZD-0，第二组为ZD-1，以此类推洛稻。贴好标签后，向每个培养皿中加入50颗种子。

试剂的配制与添加：分别称取15.7g，23.92g，35.67g，44.738g，52.396g的聚乙二醇（PEG），溶于200ml的无菌水中，充分搅拌至无悬浮。按照标签，对应向培养皿中加入10ml配好的不同浓度梯度的PEG溶液。若培养皿中滤纸没有贴合培养皿底部而产生气泡，可用枪头将气泡赶出。

种子的培养与处理：将培养皿放进25℃的恒温箱中培养七天，在培养过程中定期检查并加水。七天后取出培养皿，用镊子去除根芽，将留下的种子放入试管保存于液氮中。取出20颗种子去壳，低温保存，操作动作要快，避免酶失活。文献综述

2.3 实验方法

2.3.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）

试剂的配制：0.05mol/L磷酸缓冲液（PBS，pH7.8）：分别取A母液228.75ml，B母液21.5ml，用蒸馏水定容至1000ml，即pH7.8的0.05mol/L磷酸缓冲液。其中A母液即0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液的配制：取71.7g的 Na2HPO4.12H2O，充分溶解，用蒸馏水定容至1000ml ； B母液即0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液的配制：取31.2g NaH2PO4.2H2O，充分溶解，用蒸馏水定容至1000ml[6]。30μM EDTA-Na2 溶液：称取0.001g用MEDTA-Na2磷酸缓冲液定容至100ml。2.25mM 氮蓝四唑溶液：称取0.1840g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml，且避光保存。60μM 核黄素溶液：称取0.0023核黄素，用力氨酸缓冲液定容至100ml，避光保存。14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。

酶液的制备：称取0.2g去壳的种子样品，洗净后置于预冷的研钵中（研钵放在冰上，并加入1.6ml pH7.8的磷酸缓冲液研磨成浆，后转入离心管，在4℃、12000rpm下离心20min，取上清液即酶液。

酶活性测定：分别取已经配好的Met溶液162ml，EDTA-Na2 溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml，混合后摇匀，配制成反应混合液。在试管中加入30μl 酶液和3ml 反应混合液，并写好相应的编号。同时做两支对照管，其中一支只加缓冲液置于暗中，测定时用于调零用，另一支试管加30μl 磷酸缓冲液和3ml反应混合液，照光后测定作为最大光还原管。用不照光的试管为对照管调零，避光测OD560的值。酶活性计算：SOD总活性= [（Ack－AE）×V] /﹙1/2 Ack×W×Vt﹚。在方程式中SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；Ack 光照对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；Vt为测量时的酶液用量（ml，30ml）；W为样品鲜重（g，0.2g）[7]。来.自/751论|文-网www.751com.cn/

2.3.2 POD酶活性的测定 (愈创木酚法)

试剂的配制：分别取A母液123ml和B母液877ml充分混匀即为1000ml的0.2mol/L磷酸缓冲液（pH6.0）；取200ml 已配好的PBS，加入0.076ml液体愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入0.112ml 30%的H2O2，混匀即反应混合液，并置于冰箱中保存。

样品测定：以PBS为对照调零，取3ml 反应液并加入30μl酶液，每隔30s测定OD470值，测定时边加样变测定，测定前等待5s，并记录OD值。 模拟干旱对水稻种子萌发过程中抗氧化酶活性的影响(2):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_74428.html