3.3.2 酶切 13

3.3.3 目的基因的连接 14

3.3.4 再次转化筛选 14

3.4 诱导产酶 14

3.4.1 毕赤酵母电转化方法 14

3.4.2 菌体的准备 14

3.4.3 电击转化 14

3.4.4 诱导产酶培养 15

3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳 15

3.5.1 染色和脱色 15

3.6 弹性蛋白酶酶活力的测定 15

4 结果与讨论 16

结论 19

参考文献 20

致 谢 22

引言：

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，是一种典型的机会致病菌，在人体烧伤、器官移植等情况下引起严重感染，危害人体健康甚至生命。该菌产生多种蛋白酶之一的弹性蛋白酶，其英文术语为pseudolysin，也称Pseudomonas  aeruginosa  neutral  metalloproteinase、Pseudomonas aeruginosa elastase、Pseudomonas elastase。这种蛋白酶是属于蛋白酶M4 家族的，即嗜热菌蛋白酶家族（thermolysin family）。弹性蛋白酶是由铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）产生的一种胞外分泌型的锌金属蛋白酶[1-4]。它由lasB基因编码，该基因的开放阅读框含有 1497 个碱基对，编码分子量为 53.7kDa的多肽（498 个氨基酸残基，prepropseudolysin）。在这个多肽的氨基酸序列中，前 23 个氨基酸残基为信号肽（signal peptide），其分子量为 2.4kDa；然后是有 174 个氨基酸残基组成的前导肽（propeptide），它的分子量是 18.2kDa；最后是由 301 个氨基酸残基组成，分子量为 33.1 kDa的成熟蛋白酶（mature protease）[1,2,5]。当弹性蛋白酶的成熟蛋白分泌到细胞外，可以降解病灶细胞外基质，在铜绿假单胞菌感染的过程中起重要作用。因此，获得纯化的弹性蛋白酶，对于研究其致病机理，具有重要意义。论文网

弹性蛋白酶在实际生活生产中有很高的应用价值，广泛存在于自然环境中的角蛋白，就可以被弹性蛋白很好的降解，在羽毛蛋白方面弹性蛋白发挥着重要的作用，同时它在食品行业、日常化学化工领域具有很好的前景，拥有比较高的商业和应用价值[6-8]。在食品行业，因为弹性蛋白酶广泛的水解底物，非常多的动植物蛋白都能被它所水解，尤其是动物韧带、筋腱等动物组织中的一些难以被处理的蛋白，因此弹性蛋白酶在农副产品的深加工以及高蛋白的食品的制作等方面具有一定的应用价值[9，10]。在化学工业上，由于弹性蛋白酶在有机溶剂的较好的稳定性和较高的活性广泛用作多肽和成的催化剂。除此之外，弹性蛋白酶还具有能够维持纤维血管正弹性的特别功能，而且还能发挥出增进、改善皮肤的血液循环，改善皮肤代谢，延缓皮肤老化，促进毛发的生长，有效的预防头发脱落的作用[11]。

我国的弹性蛋白酶一般的制备方法是从动物的胰脏部位用水提取而得到的[12]。或者是通过直接从细菌培养上清液中提取弹性蛋白酶，因为产量比较低、纯化很困难，不能够很好地满足研究工作和市场的需求[13]。所以我们现在试着利用微生物发酵表达的方法，经过连锁的生物化学手段来解决这一问题[14]，假如利用基因工程的手段来建立表达性得工程菌来大量制备高纯度弹性蛋白酶，将为对该酶的进一步研究和开发提供良好基础。 在前导肽引入N-糖基化位点促进弹性蛋白酶在毕赤酵母中的表达(2):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_74626.html