为了在植物体内生产出分支化程度得到进一步提高的淀粉，从而改善淀粉的冻融稳定性，将大肠杆菌糖原分支酶(glycogen branching enzyme,glgB)基因融合到黑曲霉GASBD基因的5′-末端或3′-末端，并将合成的这两个融合基因转化到马铃薯栽培品种Desiree中。在本研究中，主要对glgB/GASBD融合基因以及glgB基因在马铃薯中的表达对淀粉分支程度的影响进行研究。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料

三个马铃薯转基因系列：分别为glgB-GASBD、GASBD-glgB和glgB转基因系列。

1.1.2 酶与试剂

反转录试剂盒购自Invitrogen 公司(美国)；直链、支链淀粉标准品和异淀粉酶购自于Sigma公司(美国)；β-巯基乙醇；氯仿；异丙醇；乙醇；TE缓冲液；Mini Trans-Blot System (Bio-Rad，美国)；硝酸纤维素膜(Milliper公司，美国)； TTBS缓冲液；TBS缓冲液；3,3'-二氨基联苯胺四盐酸。

1.2方法

1.2.1 转化植株的PCR检测

通过CTAB法[4]提取转化植株和对照植株的叶片基因组DNA(叶片取自于70天的盆栽苗)。首先取100 mg 新鲜的马铃薯叶片，用液氮冷冻研磨成粉末，加入500µL 65℃预热的CTAB 抽提液(2% CTAB，1.4M NaCl，20 mM EDTA，100 mM Tris-HCl)和10µL β-巯基乙醇，轻轻混匀后放入65℃水浴保温30 min，加等体积的氯仿：异戊醇(24:1)混合液，进行混匀，在4℃，13 000g离心5 min，然后取300µL上清液以及加入300µL预冷的异丙醇，静置20 min，13 000g离心10 min，最后沉淀用70%乙醇清洗2次，置于室温干燥后，在30μLTE缓冲液中溶解。

按照大肠杆菌glgB基因序列，用Primer 5.0软件设计一对特异性引物，引物序列分别是：5'–GGGATTCTTTAGCGGCGTCATTC–3' 和5'–ATCAGCACCGAGCGTTCTTTGTC–3' ，预期扩增片段大小为1720 bp。PCR反应体系是：基因组DNA 2μL，引物各1μL，2.5 mM dNTPs 2μL，10×PCR反应缓冲液2.5μL，Taq酶1μL，加双蒸水到25μL。PCR反应程序为：95℃ 4 min，95℃ 60 s，52℃ 45 s，72℃ 90 s，35个循环，72℃延伸10 min。文献综述

1.2.2 半定量RT-PCR分析

从所有转基因植株的块茎中提取总RNA[5]，采用Thermo Scientific RevertAid First cDNA Synthesis Kit方法合成cDNA第一链，然后将新合成的cDNA第一链作为扩增模板，最后用Taq聚合酶进行PCR扩增。在检测转基因马铃薯中外源基因的mRNA积累量时，将非转基因的马铃薯作为阴性对照。

对转基因马铃薯进行RT-PCR分析所使用的引物和转化植株的PCR检测一样。PCR反应体系是：cDNA第一链反应液2μL，引物各1μL，2.5mM dNTPs 2μL，10×PCR反应缓冲液2.5 μL，Taq DNA聚合酶1μL，加不含RNase的双蒸水至总体积25μL。PCR反应程序是：94℃预变性2 min；94℃ 30s；52 ℃ 45s；72℃ 90s，35个循环；72℃延伸10min。作为内参的马铃薯actin基因的引物为5'- GGAG来!自~751论-文|网www.751com.cn TCTGGCATCATACAT-3'和5'- GTTGGAAGGTACTTAAAGAAGCC-3'，预期扩增片段长度为800 bp。PCR反应体系和glgB基因的扩增体系一样。PCR 循环参数是：94℃预变性2min；94℃ 30s，54℃ 45s，72℃ 60s，30次循环；72℃延伸10 min。

1.2.3 马铃薯淀粉的提取

将每个转基因株系的5株马铃薯植株的薯块混合后，取0.5kg马铃薯洗净，用小刀把皮削去，切成2到3 cm小块，然后用组织匀浆机把1 L含有0.1% Na2SO3的去离子水中进行匀浆，经4层纱布进行过滤后，用2 L含0.1% Na2SO3的去离子水冲洗滤渣。滤液于4℃静置12h后弃上清，淀粉沉淀用去离子水清洗三次后平放在滤纸上，最后将自然晾干的淀粉研磨成粉，则得到马铃薯淀粉。

1.2.4 Western斑点杂交分析来!自~751论-文|网www.751com.cn glgB/GASBD融合基因在马铃薯中的表达对淀粉分支程度的影响(2):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_76315.html