1。2试验步骤

在线上核苷酸序列库中查找提取相关物种的TAS1R1序列在NCBI上查找牛的TAS1R1序列。根据已知结论【4】,牛的六号外显子是编码TAS1R1序列的,先找到TAS1R1的CDS区,检验其编码的起始序列是否为AUG（是则为正向编码,不是则为反向编码需从CDS区的末尾开始提取）。在Genebank中下载完整的牛的TAS1R1序列并保存。

将提取好的TAS1R1六号外显子序列在整个序列库中进行BLAST序列比对。提取BLAST结论中序列保守性高于60%的物种序列,同样找到TAS1R1的CDS区,检验其编码的起始序列是否为AUG（是则为正向编码,不是则为反向编码需从CDS区的末尾开始提取）。分别下载保存其mRNA序列。

打开软件DNAstar点击Seqman按键,在该软件的应用程序中开始对序列进行智能拼接和基础水平的软件编辑。（要想让TAS1R1序列的准确性提高不影响最后结果的分析,其基因重叠的长度应为50个碱基以上）。利用软件中的Seqman功能将现有的序列进行剪切,主要原则是评价序列结果中的信号强弱,最终对信号比较弱的两端序列进行合理剪切,中个过程由该程序自动运行生成,剪切对象也是程序自动进行选择并编辑的结果,编辑结束后可以确定拼接序列的方向。选中序列中能够测通整个反应的序列,找出引物序列后以此为依据确定所有序列的方向。

把不同的序列按物种分类并分别保存为seq文件的格式。使用clustalx软件的比对功能将序列中的保守区域对齐并校对,人工校对找出保守序列完成比对之后,使用bioxmsetup26软件进行最后的调整,确定该序列的最终长度,消除空格,根据密码子三个位点进化速率的不同使其最终序列的第一个碱基可以确保出现在三联体密码子的位置上。以提高发育树构建的准确性和成功率。

打开 http://www。expasy。org/tools/dna。html,将修饰过的MRNA序列添加在框内,点击按钮开始翻译。人工筛选翻译出的氨基酸序列（选取最长的描红区域）保存在txt文件中。将text文件修改成fasta格式序列文件（fasta格式：大于号>后紧跟序列名,换行后是序列。举例如下）。不同的序列可以分别保存,也可以把所有序列放在同一文件内。示例：来!自~751论-文|网www.751com.cn

核酸序列：

>sequence1_名称

CGTCGCACACGAGGTTCGCTGA

氨基酸序列：

>sequence2_name

MSQPNISFAELQIGKKAGRTF

用clustalx软件转化成FASTA模式。安装打开mega软件,选取原有的FASTA模式文本转化成MEGA模式。

本试验中我们使用多种方法来构建生物系统发育树,多重结果校对后取最终结果,可以最大程度的保证该发育树的准确性、可靠性。一般情况下我们构建生物系统发育树。通常使用的方法有三种如最大似然法（Maximum Likelihood,ML）（也称为最大概似估计法）、最大简约法（Maximum parsimony）和邻接法(Neighbour-Joining）。参照NCBI中己知的脊椎动物等近缘物种的相应基因序列表,用clustalx软件将基因全序列进行比对,然后采用软件用邻近法(Neighbour-Joining）构建分子进化树来进行系统发育分析。重复检验生物系统发育树各分支的自举检验值(bootstrap)为1000,完成生物系统发育树的构建。建树后生成bootstrap consensus tree和original tree都能用,后者更常用。使用线上Clustal比对出保守序列区。