2.2.9 嗜盐菌株的培养及其生长曲线测定

将150mL嗜盐菌液体培养基加入三角锥形瓶中，放入条件为37℃、200 rpm的THZ-C恒温振荡器中振荡培养。以空白液体培养基为对照，使用紫外可见分光光度计每隔2小时检测菌体浓度，检测波长设置为600nm。每次检测都设置3组平行实验，检测结果取平均值，以此绘制出嗜盐菌生长曲线[7]。

2.2.10 不同浓度KCl溶液对嗜盐菌株生长的胁迫影响文献综述

配制不同浓度梯度的KCl溶液（mol/L）：0、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050、0.055、0.060、0.065、0.070、0.075、0.080。

配制碘化丙啶（PI）染液母液：10mg PI溶解于2mL 超纯水中，4℃避光保存。

配制PBS缓冲液（0.1 mol/L）[8]： 

（1）母液A（0.2 mol/L Na2HPO4溶液）：称取71.64g Na2HPO4·12H2O，溶解于1000 mL蒸馏水。

（2）母液B（0.2 mol/L NaH2PO4溶液）：称取31.21g NaH2PO4·2H2O，溶解于1000 mL蒸馏水。

（3）根据所需的缓冲液pH值将母液A、B按下表2-1中的比例混合，再用蒸馏水稀释至200mL：

表2-1 缓冲液母液A、B混合比例

pH 母液A/mL 母液B/mL

7.0 61.0 39.0

7.1 67.0 33.0

7.2 72.0 28.0

7.3 77.0 23.0

7.4 81.0 19.0

7.5 84.0 16.0

2.2.10.1 预实验：研究嗜盐细菌受KCl溶液胁迫最适的处理时长

配制嗜盐菌液体培养基，培养嗜盐菌。根据嗜盐菌生长曲线，取位于对数生长期的菌体，加入2g/L浓度的KCl溶液，分别胁迫不同的时长：0.5小时、1.0小时、1.5小时、2.0小时、2.5小时、3.0小时。胁迫完成后，6000 rpm离心3分钟，弃去KCl溶液，保留菌体，加入等体积的PBS缓冲液洗脱。重复以上离心洗脱步骤两次。再加入PBS缓冲液制成菌体悬液，利用血球计数板计数，计算出菌体悬液中的总菌数值。适当稀释菌体悬液，适宜流式细胞仪检测的样品浓度为106-107个/mL。吸取500μL 稀释悬液，加入1μL PI染液母液，避光染色25分钟后，用滤膜过滤除杂。以未经KCl溶液胁迫并未染色的菌体为阴性对照，以未经KCl溶液胁迫并染色的菌体为阳性对照，进行上样检测。将样品放入流式细胞仪，通过 660/16 nm带通滤片（FL3）检测荧光强度信号，以FL3-H表示，最后得到FCM图谱[9]。来!自~751论-文|网www.751com.cn

2.2.10.2 研究不同浓度梯度的KCl溶液对嗜盐细菌生长的胁迫影响

   配制嗜盐菌液体培养基，培养嗜盐菌。根据嗜盐菌生长曲线，取位于对数生长期的菌体，分别加入不同浓度梯度的KCl溶液，以预实验研究得到的适宜时长进行胁迫处理。胁迫完成后，具体的离心洗脱步骤同上。之后加入PBS缓冲液制成菌体悬液，适当稀释以达到适宜的上样浓度。在500μL 稀释悬液中加入1μL PI染液母液，避光染色25分钟后，过滤除杂。以未经KCl溶液胁迫并未染色的菌体为阴性对照，以未经KCl溶液胁迫并染色的菌体为阳性对照，进行上样检测。步骤同上。