（5）手工(或样品混匀仪)上下翻转样品15-20min，混匀管内容物使之成为乳浊液。第一次向样品管内加入平衡酚时，翻转样品管1小时以上蛋白抽提效果较好，更容易转移上清液。

（6）将混匀后的离心管置于离心机中，4℃下，10000rpm离心10min,使有机相与水相充分分离。用剪口的钝枪头轻轻吸取水相（上清液），转移至新的无菌离心管中，弃去两相界面的蛋白质和下层有机相。（离心后样品管内液体被分为三层，上层水相上清液，中层蛋白质层，下层有机相）。

（7）第二次加入与上清液等体积平衡酚，重复步骤4-6。

（8）向离心管中加入与上清液等体积的酚和氯仿 （酚：氯仿=1:1）：上清液体积=1:1，重复步骤5-6。

（9）重复步骤8，直至两相界面看不到蛋白质层。

（10）向离心管中加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇混合物（氯仿：异戊醇 =24:1），重复步骤5-6。

（11）向离心管中加入2倍抽提物体积的-20℃预冷无水乙醇，立即上下翻转混合至絮状DNA出现。

（12）将酒精沉淀DNA 10000rpm离心10min（4℃），缓慢倒掉酒精，或用移液枪枪尖将絮状DNA挑出来放入新的无菌离心管中。 向离心管中加入300uL 70%乙醇洗涤DNA沉淀，缓慢倒掉70%乙醇，再重复洗涤一次。来`自^751论*文-网www.751com.cn

（13）倒掉酒精后的离心管倒置或平放在纸巾上使其在室温下空气干燥至酒精完全挥发，根据DNA沉淀量加入200-400ulL TE缓冲液溶解DNA沉淀。

（14）将待溶解DNA沉淀置于摇床缓慢摇动24小时，促进DNA溶解。

（15）DNA原液-20℃保存备用。

2.5  PCR扩增及电泳检测

PCR反应体系: 10×PCR buffer (37.5 μL)、10 mMdNTPs (12 μL)、Taq DNA聚合酶(3U)、10 μM上下游引物(各0.4μL)、DNA 模板(30μL)、加ddH2O至30μL。

PCR反应程序: 95℃预变性2 min后，接着95℃变性30 s, 再50℃退火30s,后72℃延伸1 min, 总共35个循环; 最后在72℃环境中延伸5 min, 最后在4℃环境下保存。

PCR扩增产物的检测:在230V的电压下，将10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，接着进行银染照相。以每个个体的电泳结果显示的条带位置的差别作为依据来确定各自的基因型，并且用100 bp DNA ladder marker来作为对照。

2.6  数据处理

    利用POPGENE3.2软件，统计并且分析各地区克氏原螯虾群体PclG07微卫星位点的有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、基因流(Nm)、遗传分化指数(Fst)、遗传相似性系数(JN)和遗传距离(D)等参数。Hardy-Weinberg平衡偏离指数计算公式为