2 实验材料与方法

2.1土壤样品采集

实验器材：无菌保鲜袋。

采样于淮安农村的某麦田，随机选取几处采样点。选取小麦根部的土壤作为土壤样品。

2.2 制备土壤稀释液

 实验器材：土壤样本、超纯水、无菌试管、无菌吸头、无菌三角瓶、摇床、电子天平。

 实验过程：用电子天平秤取1.0g麦田土壤样品放入盛有99mL超纯水的无菌三角瓶中，放入摇床中震荡10min形成均匀的悬液。使用移液枪从三角瓶中吸取1mL土壤悬液，加入装有9mL超纯水的无菌试管中混合均匀，标记为10-1稀释液。再从该10-1稀释液的试管中吸取1mL液体，加入下一支装有9mL超纯水的无菌试管中混合均匀，标记为10-2稀释液。以此类推，获得10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8八个稀释梯度的土壤稀释液。文献综述

2.3 培养基与试剂

LB培养基（g/L）：牛肉膏5.00g，蛋白胨10.00g，NaCl 10.00g，去离子水1000 mL，pH7.0～7.2，固体培养基加琼脂粉1.5 g/100 mL。

DNA电泳缓冲液TAE：配制50倍浓TAE（pH8.5），2 M Tris-醋酸，100 mM EDTA；电泳时或配制琼脂糖凝胶时用去离子水稀释至1倍浓TAE缓冲液。

菌株鉴定过程中用到的taq酶等分子试剂购自溥博生物科技（徐州）有限公司。

2.4 涂布培养

 实验器材：涂布器、LB培养基

 实验过程：将占有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧30s,然后冷却8～10s。吸取50ml菌液，滴加到培养基表面。用涂布器将菌液均匀的涂布在培养基表面，涂布时转动培养皿，使涂布均匀。将涂布好的平板平放于桌上20～30min，使菌液渗透入培养基内，然后将培养基倒转，放入37℃温箱培养48小时，标注不同稀释浓度的培养基标号以便区分。

2.5 划线培养

实验器材：接种环、移液枪、移液管 、LB培养基

实验过程：将接种环放置于火焰上灼烧至发红，然后在火焰旁冷却接种环。将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液（过程中一定要注意防止菌液被杂菌污染）。左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划五至六条平行线，盖上皿盖（注意不要划破培养基）。灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三区域内划线。注意不要将最后一区域内的划线与第一区相连。将平板倒置，放入培养箱中培养。

2.6 菌株16S r-DNA的扩增与序列分析

2.6.1 PCR扩增原理

以细菌的基因组DNA为摸板，采用通用引物扩增菌体的16S rDNA序列，引物正向序列：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向互补序列为： 5'-TTCAGCATTGTTCCAT-3'。

PCR反应体系（50μL）为：2×Taq聚合酶反应缓冲液25 µL，DNA模板1µL，Primer F (10µM) 1µL, Primer R (10µM) 1µL, 加无菌水至50 µL。

PCR扩增反应条件: 预变性95℃ 5 min; 变性94℃ 30 s，退火 54℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min, 30个循环；最后72℃延伸20min，降温至10℃保持5 min。

2.6.2 琼脂糖凝胶电泳

（1）称取0.75g的琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，加入100 mL 1×TAE电泳缓冲液。然后置于微波炉加热至完全溶化，溶液均匀透明。冷却至60℃左右，在胶液内加入适量的核酸染料Goldview。

（2）取制胶板槽，水平放置胶槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面，凝胶厚度约为3~5 mm。

（3）待凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极端放进电泳槽内。来`自^751论*文-网www.751com.cn 麦田土壤微生物菌株分离鉴定及微生物学特性(2):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_79936.html