5    30    5    3    0    1    500    5/10    0    20
6    30    5    0    10    20    500    1/2    0    5
7    30    5    0    0    1    200    1/2    24    20
8    30    1    0    0    20    500    5/10    24    5
9    10    5    3    0    20    500    5/10    0    5
10    10    1    3    0    20    500    1/2    24    20
11    30    1    3    10    1    500    5/10    24    5
12    10    1    0    10    1    500    5/10    0    20

3.3相应面实验设计
为了提高试验的可靠性，根据单因素试验和PB 筛选的3个显著因素：震荡次数、超声时间、加入提取液量进行响应面优化，共17组试验，以辅酶含量为响应值，确定酵母细胞内辅因子NAD+、NADH提取得率的最佳工艺参数，试验设计如表3-2所示。
表3-2 响应面试验方案
Table 3-2  Analysis of response surface analysis
序号    震荡次数（次）    超声时间（min）    加入提取液量（mL）    辅酶含量（umol/L）
1    10    10.5    5    0.71
2    5    10.5    3    1.21
3    5    1.0    5    1.57
4    10    20    3    1.41
5    5    20    1    1.4
6    0    10.5    5    2.04
7    0    10.5    1    1.18
8    10    10.5    1    0.92
9    0    20    3    1.17
10    5    10.5    3    1.45
11    5    10.5    3    0.41
12    0    1    3    1.47
13    5    20    5    2.07
14    5    1    1    2.15
15    5    10.5    3    2.2
16    5    10.5    3    2.1
17    10    1    3    2.14

3.4 NAD+/NADH检测条件优化
3.4.1 高效液相色谱法
一个好的分析方法必须满足以下要求：①特异性和专一性强，②灵敏度高，并且较稳定，③手续简便易行，④准确度好，⑤重现性好。而选择一个特异、有效的检测指标是建立分析检测方法的前提。检测酵母细胞内辅酶NADH/NAD+的关键步骤为:胞内辅酶的高效提取及辅酶含量的准确测。NAD+因其极性较弱而易保留在疏水性强的色谱柱中,致使其被洗脱的时间较长,峰形展宽,分离不够理想。当在洗脱液中加入带正电荷的配对离子四丁基氢氧化铵后, NAD+等化合物中带负电荷的部位便与之结合,致使整个化合物分子 所带的电荷减少,极性减弱。由于NAD+与配对离子结合后其极性减弱相对地较少,而其它辅酶的极性减弱较多,所以NAD+先被洗脱。此外,由于在洗脱液中增加了弱极性的有机溶剂的比例,各化合物的出峰时间均提前,从而缩短了样品的总分析时间。NADH在紫外260nm处有主吸收峰，在340nm有其特征吸收峰。其激发光谱和发射光谱波段分别为340nm和460nm，因此，紫外吸收光谱，特别是A340可作为检测和分析NADH的主要指标，因为NADH在紫外340nm有独特的吸收峰，而其类似物NAD以及其它许多胞内蛋白、核酸等物质在340nm处没有吸收特征吸收峰，所以A260和A340也是估计NADH纯度的重要指标。高效液相色谱(HPLC)具有高的灵敏度和准确度，且能进行有效的分离，灵敏度高，分离效果好。 生物转化2-苯乙醇辅因子NADH/NAD+的检测研究(7):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_1743.html