过量铜及甲基紫精对MSR的表达调控研究(3)

    LSLB 培养基：每升培养基含5g 酵母粉，10g 蛋白胨，5gNaCl。固体培养基
每升加 15g 琼脂。调节 PH 值至 7.2。主要用于大肠杆菌的培养。
    YEB 培养基：每升培养基含 10g 酵母粉，10g 蛋白胨，5g 牛肉浸膏。固体
培养基每升加 15g 琼脂。调节 PH 值至 7.0。主要用于农杆菌的培养。
    N6D培养基：每升培养基含3.99g chu N6 Basal Medium，0.1g Myo-inositol，2.878g Proline，0.3g Casamino acid，30g Sucrose,2mg/L 2,4-D，固体培养基每升加15g Gellan gum。调节PH值至5.8。
    2N6-AS培养基：每升培养基含3.99g chu N6 Basal Medium，0.1g Myo-inositol，2.878g Proline，0.3g Casamino acid，30g Sucrose，10g Glucose，2mg/L 2,4-D，固体培养基每升加15g Gellan gum。调节PH值至5.8。
    N6DS培养基：每升培养基含3.99g chu N6 Basal Medium，0.1g Myo-inositol，2.878g Proline，0.3g Casamino acid，30g Sucrose，2mg/L 2,4-D，1mL 100mg/mL cef，1mL 50mg/mL hyg，固体培养基每升加15g Gellan gum。调节PH值至5.8。
    MS-NK培养基：每升培养基含4.43g MS Basal Medium，2g Casamino acid，30g Sucrose，30g Srobitol，0.02mg/L NAA，2mg/L Kinetin，固体培养基每升加15g Gellan gum。调节PH值至5.8。
    MS-HF培养基：每升培养基含4.43g MS Basal Medium，30g Sucrose，固体培养基每升加15g Gellan gum。调节PH值至5.8。
    GUS染色液：每50mL染色液含5mL 1MNaH2PO4，1mL 0.5M Na2EDTA，50μL trionX-100，3.25ml 0.1M K3Fe（CN），3.25ml 0.1M K4Fe（CN），10ml 10mg/ml X-Gulc，ddH2O补齐至50mL。
1．2 试验方法
1．2．1 Cu和MV处理下OsMSRA4.1基因表达量测定
1．2．1．1 Cu和MV处理水稻Dongjin幼苗
    用木村B营养液+8μM/L CuSO4处理水稻Dongjin幼苗三株，并在0、0.5、2、6、12、24、48h时对幼苗取叶片液氮保存。
    用木村B营养液+1μM/L MV处理水稻Dongjin幼苗三株，并在0、0.5、2、6、12、24、48h时对幼苗取叶片液氮保存。
1．2．1．2 测量上述叶片表达量
    选取水稻OsActin-1基因（LOC_Os03g50885）作为稳定的内参基因，在http://rice.plantbiology.msu.edu/上查询OsMSRA4.1（LOC_Os10g41400）的基因编码序列（CDS），使用Primer Premier 5.0设计两者的qPCR引物：
        OsActin-1基因上游引物（Actin1_F）：5’-TATGCTCTCCCCCATGCTATC-3’
        OsActin-1基因下游引物（Actin1_R）：5’-CCGTTGTGGTGAATGAGTAACC-3’
        OsMSRA4.1基因上游引物 (MSRA4_F)：5’-ACCGCCAGGGTAATGATGT-3’
        OsMSRA4.1基因下游引物 (MSRA4_R)：5’-CTTCTCCTGCTCAGGGGTG-3’
    每片叶子取0.1g使用RNA提取纯化试剂盒提取RNA并用DNase І消化DNA，使用反转录试剂合成cDNA。使用荧光定量试剂盒，两步法在实时荧光定量PCR仪中进行荧光定量PCR扩增。根据OsMSRA4.1基因和OsActin-1基因相对荧光变化的Ct值，采用2-ΔΔCt法定量分析处理后不同时间OsMSRA4.1基因的表达量。
1．2．2 GUS重组载体的构建
1．2．2．1 引物的设计与合成
    OsMSRA4.1和OsMSRB3基因的定位号分别是LOC_Os10g41400和LOC_Os05g33510，根据定位号从网站 www.rice.plantbiology.msu.edu 获得他们的序列信息。并据此利用 Premier 5.0 生物设计软件设计相应的引物：
        ProA4上游引物（ProA4-F）：5' AACAGAAACAGCGGTGATTCTTAG 3'
        ProA4下游引物（ProA4-R）：5' CGAGGGAGGCTTTTCCTTTC 3'
        ProB3上游引物（ProB3-F）：5' GTGGCGAAGAAGGGATTCAC 3' 过量铜及甲基紫精对MSR的表达调控研究(3):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_22858.html