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水稻细菌性条斑病菌三个Xop基因功能研究相关载体的构建(2)

时间:2018-10-13 09:32来源:毕业论文
1 材料与方法 1.1PCR扩增目的条带 扩增片段1: 240 xopAF pro -u(EcoRI)gaattcCGCCAGCTTCGCATCCA 241 xopAF pro -d(ApaI)gggcccGTGAGTCATTCATTGCCCAGT 240+241扩增片段大小:453bp 用


1 材料与方法
1.1PCR扩增目的条带
扩增片段1:
240 xopAF pro -u(EcoRI)gaattcCGCCAGCTTCGCATCCA
241 xopAF pro -d(ApaI)gggcccGTGAGTCATTCATTGCCCAGT  
240+241扩增片段大小:453bp
用途:扩增xopAF启动子,后反向连接到pHM1 lacZ 启动子下,消除pHM1 lacZ启动子的影响,xopAF启动子融合eGFP 和cya 表达,观察xopAF启动子是否受到植物诱导表达
扩增片段2:
242  xopAF pro- u(HindIII)aagcttCGCCAGCTTCGCATCCA
243  xopAF pro- d(NcoI)ccatggGTGAGTCATTCATTGCCCAGT  
242+243扩增片段大小:453bp
用途:扩增xopAF启动子,后直接连接到1300NG载体,xopAF启动子融合gusA表达,瞬时转化烟草,观察xopAF启动子在植物中被诱导表达
扩增片段3:
244  xopAF pro+CDS-u(ApaI)gggcccCGCCAGCTTCGCATCCA
245  xopAF pro+CDS+flag-d(BglII)agatct TTA TCA CTT ATC GTC GTC ATC CT TGTA ATC ATCGCGGAGCTGCTCCGTA
244+245扩增片段大小1.3kb
用途:扩增xopAF启动子+编码区+两个FLAG标签,连接到PHM1,转入xopAF突变体,用于利用FALG标签western测定xopAF启动子及其蛋白在不同的培养条件下的诱导表达
扩增片段4:
342xopAF pro+CDS-d (BglII)agatctATCGCGGAGCTGCTCCGTA
用途:244+342扩增xopAF启动子+编码区去掉终止密码子,便于同GFP,CYA做融合表达,检测蛋白分泌到植物细胞以及在植物细胞中的定位
扩增片段5:
246  xopAK pro-u(EcoRI)gaattcTCGGAAGACTGCCGGAGA
247  xopAK pro-d(ApaI)gggccc GGAGTCAGAACCGCCCG    
246+247扩增片段大小:467 bp
用途:扩增xopAK启动子,反向连接到pHM1 lacZ 启动子下,消除pHM1 lacZ启动子的影响,xopAF启动子融合eGFP 和cya 表达,观察xopAF启动子是否受到植物诱导表达
扩增片段6:
248  xopAK pro-u(HindIII)aagcttTCGGAAGACTGCCGGAGA
249  xopAK pro-d(NcoI)ccatggGGAGTCAGAACCGCCCG   
248+249扩增片段大小:467 bp
用途:扩增xopAK启动子,直接连接到1300NG载体,xopAK启动子融合gusA表达,瞬时转化烟草,观察xopAF启动子在植物中被诱导表达
扩增片段7:
250  xopAk pro+CDS-u(ApaI)gggccc CGGAAGACTGCCGGA250  
251xopAk pro+CDS+flag-d(BglII)agatctTTATCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC CCACGACTTGTAGTAATAGAT  
250+251扩增片段大小:1.25kb
用途:扩增xopAF启动子+编码区+两个FLAG标签,连接到PHM1,转入xopAF突变体,用于利用FALG标签western测定xopAF启动子及其蛋白在不同的培养条件下的诱导表达
扩增片段8:
343xopAk pro+CDS-d(BglII)agatctCCACGACTTGTAGTAATAGAT
用途:250+343去掉终止密码子,便于同GFP,CYA做融合表达
扩增xopAK启动子+编码区去掉终止密码子,便于同GFP,CYA做融合表达,检测蛋白分泌到植物细胞以及在植物细胞中的定位
扩增片段9:
252  Cya-u (ApaI) gggcccATGCAGCAATCGCATCAGG
253  Cya-d(BglII)agatctCTGGCGTTCCACTGCG   
252+253扩增片段大小:1.2 kb
用途:扩增Cya编码区
扩增片段10:
266  GFP+-u(ApaI)  gggcccATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACT
267  GFP+-d (BglII)  agatctTTATTTGTAGAGCTCATCCATGCC  
252+253扩增片段大小:720bp
用途:扩增GFP编码区
扩增片段11:
259 XopAF orf-(SacI) gagctcATGGTGCCTGTTACCTACTATCAGAAAGC    
462 XopAF orf-R(SalI) gtcgacTTATCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCATCGCGGAGCTGCTCCGTA
259+462扩增片段大小:684bp
用途:扩增 XopAF编码区+flag,连接到载体P2300-d35S,编码区在双35S 启动子下超表达,注释烟草,用于通过OCTET(生物膜干涉检测)或Co-IP方法筛选互作蛋白
扩增片段12:
261 XopAK orf-F(SacI) gagctcATGAAGCCGGCTTGCATCA 水稻细菌性条斑病菌三个Xop基因功能研究相关载体的构建(2):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_24091.html
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