Chl a:Ca=12.21 A663-2.81 A645;
Chl b:Cb=20.13 A645-5.03 A663;
β-胡萝卜素浓度Cx+c=(1000 A470-3.27 Ca-104 Cb)/229
计算得出细胞色素的浓度后(mg.L-1),然后换算成单位鲜重的叶片所含的色素的量(mg.g-1)。
1.6 透射电镜观察叶绿体结构
剪取三叶期的野生型9311和zl3突变体的斑马叶的横白条纹处进行透射电镜(Transmission Electron Microcopy, TEM)的超微结构观察,叶片横切为2mm大小。随后2.5%的戊二醛溶液(25%戊二醛 10 mL, 0.2 M pH 7.2 Na2HPO4-NaH2PO4 50 mL, ddH2O定容至100 mL,4℃避光保存)室温固定24 h后4℃保存;接着1% OsO4固定;然后醋酸氧铀染色,丙酮梯度脱水(50% - 70% - 80% - 90%,每梯度15 min;100%丙酮脱水30 min,重复3次);最后包埋在环氧树脂SPURR中聚合,LEICA超薄切片机切成50-90 nm的切片。醋酸铀染色后在Hitachi H-7650透射电子显微镜下观察叶绿体结构并拍照。
1.7 植物总DNA的提取
将zl3/02428配制的F2群体发苗,从中挑取极端单株,取回后保存于-20℃冰箱内。采用SDS方法提取总的DNA。
溶液的配制
SDS提取液
NaCl 29.25 g
SDS 12 g
pH8.0,1M Tris-HCl 100 mL
pH8.0,0.5M EDTA 50 mL
加入800 mL ddH2O,置于65℃水浴锅中充分溶解,溶解后加水定容至1 L,备用。
醋酸钾(KAC)
冰醋酸 29.5 mL,ddH2O 80 mL ddH2O,混匀后置于冰上,用KOH调节pH至4.8,最后定容至100 mL,低温避光保存,备用。
DNA提取
1) 将水稻幼苗置于2.0 ml离心管中,液氮冻15min后磨成粉末。
2) 加入600 µl预热好的SDS提取液,混匀后置于65 ℃水浴锅中30 min,间歇振荡2-3次。
3) 加入150 µl -20℃预冷的醋酸钾溶液,混匀后摇匀后-20℃冰浴30 min。
4) 加入600 µl氯仿-异戊醇(24:1)溶液,上下颠倒2-3次,混匀后置于摇床上120 rmp/min 30 min。
5) 12000rpm/min 离心10min,吸取400ul上清至新的1.5ml离心管中,加入800ml -20℃预冷的无水乙醇,混匀后置于-20℃ 30min。
6) 4℃,12000 rmp/min,离心5min,倒掉上清,置于超净工作台上吹干。
7) 每管加入200 µL 的ddH2O溶解室温溶解2h,-20 ℃保存,备用。 水稻斑马叶突变基因zebra leaf3的精细定位(5):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_24254.html