摘要：本研究通过设计简并引物，结合 RACE-PCR 技术，从切花菊‘神马’中克隆得到了独脚金内酯合成基因CmCCD8。 通过与其他物种中同源CCD8氨基酸比对和系统进化树分析发现， 菊花CmCCD8和矮牵牛 PhCCD8/DAD1 的同源性最高。构建了 pBIG-CmCCD8 超表达载体，并通过农杆菌介导的叶盘转化法获得了 CmCCD8 超表达转基因菊花 OX-1、OX-2。通过统计和分析发现菊花 CmCCD8超表达转基因株系的分枝数明显减少，转基因株系叶片中 IAA 含量增加，6-BA 含量降低。转基因株系不同节间和芽中独脚金内酯合成基因 CmCCD8 及芽内负调控因子 CmBRC1 的表达上调，生长素输出蛋白基因 CmPIN1 及细胞分裂素合成基因 CmIPT2 的表达下调，说明独脚金内酯通过影响生长素、细胞分裂素的含量以及芽内负调控因子的转录表达参与调控菊花侧枝的生长发育。30404
毕业论文关键词：独脚金内酯；转基因；分枝
Cloning of Strigolactone Biosynthesis Gene CmCCD8 and Its Roleson Vegetative Growth Regulation of Chrysanthemum
Abstract ： In this study, we cloned strigolactone biosynthesis gene CmCCD8 from chrysanthemum'Shenma' using degenerate primers and RACE-PCR. The homology of chrysanthemum CmCCD8 andpetunia PhCCD8 / DAD1 was the highest in amino acids. The pBIG-CmCCD8 overexpression vector wasconstructed and CmCCD8 transgenic chrysanthemum OX-1 and OX-2 were obtained by Agrobacteriumtumefaciens-mediated leaf disc transformation. The results showed that the number of branches in thetransgenic lines was significantly decreased, and the content of IAA in the leaves of the transgenic linesincreased while the content of 6-BA decreased. The expression of CmCCD8 and the expression ofCmBRC1 in the shoots were up-regulated, and the expression of CmPIN1 and CmIPT2 weredown-regulated in the transgenic lines. It suggested that SL are involved in the regulation of the growth anddevelopment of chrysanthemum by controlling the expression of auxin and cytokinin and thetranscriptional expression, thereby negatively regulated lateral branching.
Key words: Strigolactones, transgenic, branching
目 录
引 言.4
1 材料与方法...5
1.1 试验材料、化学试剂、表达载体与菌株5
1.2 CmCCD8基因的克隆...5
1.3 CmCCD8基因序列分析及系统发育树构建...7
1.4 植物表达载体构建及遗传转化7
1.5 转基因‘神马’的发育表型观察.9
1.6 转基因‘神马’内源 IAA、6-BA 含量的测定...9
1.7 荧光实时定量 PCR...9
1.8 数据分析..10
2 结果与分析.10
2.1 CmCCD8基因的克隆.10
2.2 CmCCD8基因的多重序列比对与系统发育分析.10
2.3 转基因‘神马’的分子鉴定...12
2.4 转基因株系中分枝数的统计..12
2.5 转基因‘神马’内源 IAA、6-BA 的含量测定.12
2.6 CmCCD8调控分枝相关基因的表达.13
2.7 转基因‘神马’的株高...14
3 讨论与结论.15
参考文献...16
表 1 引物序列7
表 2 引物序列9
图 1 菊花遗传表达载体 pBIG-CmCCD8 构建流程... 7
图 2 CmCCD8 基因 PCR扩增10
图3不同物种CCD8的系统进化树10
图 4 CmCCD8 的氨基酸序列与其他物种 CCD8 的氨基酸比对. 11
图 5 CmCCD8 载体表达验证及转基因鉴定..11
图 6 转基因‘神马’的分枝表型..13
图 7 野生型和转基因株系中激素含量的测定..13
图 8 转基因株系分枝相关基因的表达..14
图 9 转基因株系的株高..15
引言：独脚金内酯（SL）是一类萜类小分子化合物，来源于类胡萝卜素（carotenoid）生物合成途径，以类胡萝卜素为前体物质，由一系列酶催化合成。Carotenoid cleavagedioxygenase 8（CCD8） ：胡萝卜素裂解双加氧酶 8。CCD8 是独脚金内酯合成途径中的一个关键酶， 它可以把独角金内酯合成过程中的中间产物 10-脱辅基-β-类胡萝卜醛酮裂解， 生成C18的 13-脱辅基-β-类胡萝卜素和 C9的二醛， 是合成独脚金内酯的中间产物。目前已从拟南芥、豌豆、矮牵牛和水稻等不同物种中分离出 CCD8基因的同源基因，分别为 MAX4、RMS1、DAD1 和 D10[1-3]。独脚金内酯在 2008 年被确定为一类新型植物激素[4]，调控植物许多生长发育过程，如抑制植株地上部分枝，促进不定根形成、根毛伸长，茎的次生生长，节间伸长等[5-6]，并能与生长素和细胞分裂素一起调控植物的分枝数量[7]。新近发现，独脚金内酯可增加拟南芥的抗旱性、耐盐性[8]及对细菌性病原的抗性[9]。MAX2（More axillary growth 2）是植物激素独脚金内酯（Strigolactone）信号途径的重要组分，Microarray 分析发现，干旱胁迫 2 h、4 h 后，分别有 1022 个、2767 个基因在 max2 中表达下调，其中 491 个、955 个基因受干旱胁迫诱导，如 MYB、NAC 类转录因子等[8-10]发现 max2 突变株的角质层较野生型薄，可能与其耐旱性下降有关。此外，拟南芥max2 突变株对细菌性胡萝卜软腐果胶杆菌病原（Pectobacterium carotovorum）敏感，发现 max2 突变体中气孔导度增加，对质外体 ROS 的耐性下降[9]。由此可见，SL 特异的在植物逆境胁迫反应中起重要作用外，还影响着植物的光形态建成、衰老等生长发育的多个方面。虽然已有人从菊花中的克隆得到 3 个具有开放阅读框的 CCD8 基因，分别命名为 DgCCD8a、DgCCD8b和 DgCCD8c，同时证明了菊花 DgCCD8 基因能够抑制侧枝生长的功能，但其不同成员克隆及其功能上的差异并没有被详细研究。本研究对 CmCCD8 过量表达转基因株系的分枝数、株高进行了分析，并且分析了分枝相关基因的表达定量，初步明确了独脚金内酯在菊花营养生长发育方面的功能。 独脚金内酯合成基因CmCCD8克隆及调控菊花营养生长特性的研究:http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_26082.html