本实验以拟南芥为材料利用PCR技术克隆启动子，构建相应的启动子融合GUS报告基因的表达载体，采用花序浸润法将构建好的表达载体转入模式植物拟南芥，利用Hyg抗性筛选得到转基因植株，并收取纯合后代。通过对转基因阳性植株进行GUS组织化学染色定位，了解拟南芥中BIO同源基因的表达模式。我们希望通过对BIO同源基因启动子的初步表达分析，来揭示BIO及其同源基因的潜在功能、调控区域和分子机理。

1.2研究的基本内容

(1) 通过序列比对，确定At4g32295和At3g24150基因的启动子序列。

(2) 分别克隆拟南芥BIO同源基因的启动子长短片段各一个。并构建相应接GUS报告基因的表达载体：pAt4g32295L:GUS，pAt4g32295S:GUS，pAt3g24150L:GUS和 pAt3g24150S:GUS，并将4个载体导入根癌农杆菌GV3101。

(3) 将含有表达载体的根癌农杆菌分别遗传转化拟南芥。用潮霉素筛选转基因植株，并对转基因植株进行收纯。

(4) GUS组织化学染色，分析启动子的活性和表达模式。为研究BIO及其同源基因的功能提供线索。

2 试剂与材料

2.1材料

本实验所用的拟南芥(Arabidopsis thaliana)品种为Columbia-0生态型，种植于光照培养箱内，长日照设置为16 h光照/8 h黑暗，温度22 ℃，湿度70%。

载体构建使用的杆菌菌株包括：农杆菌菌株GV3101和大肠杆菌菌株DH5α。

2.2试剂

限制性内切酶、Trizol、DNaseⅠ和RNase抑制剂购于Takara公司；克隆试剂盒、T4连接酶、大肠杆菌感受态细胞购于全式金公司；Premix Taq 、Maker、逆转录试剂盒、割胶回收试剂盒购于康为公司；氨苄青霉素、卡那霉素、头孢霉素、琼脂糖购于上海生工生物工程有限公司；测序服务均由博尚生物有限公司完成。

2.3主要仪器

PCR扩增仪，电泳仪、自动凝胶成像系统、离心机、恒温水浴锅、控温摇床、-80 ℃超低温冰箱和超净工作台等仪器均由杭州师范大学植物发育实验室提供。