对羟基苯甲酸的原儿茶酸开环代谢降解途径

Figure 1-1 The protocatechuate cleavage pathway for p-hydroxybenzoate catabolism

  对羟基苯甲酸的脱羧酸途径

Figure 1-2 The decarboxylation pathway for p-hydroxybenzoate catabolism

对羟基苯甲酸的苯甲酰-CoA还原途径

Figure 1-3 The benzoyl-CoA pathway for anaerobic p-hydroxybenzoate catabolism

 三条龙胆酸降解途径

Figure 1-4 Three gentisate degradation pathways

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验菌株

Bacillus sp. D1菌株

2.1.2 分子生物学相关试剂

（1）DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒、PCR纯化试剂盒、胶回收试剂盒。扩增16S rDNA的上游引物Ecoli16S-8F(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’)，下游引物Ecoli16S-1541R(5’AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3’)，上样缓冲液：6×DNA loading，Markers (DNA ladder)：宝生物有限公司。

（2）无缝克隆试剂盒：上海生工生物科技有限公司(上海，中国)

（3）感受态细胞JM109：宝生物有限公司。

（4）Nde I, Xba I 限制酶：宝生物有限公司。

2.1.3 普通试剂

蛋白胨、酵母粉、氯化钠、琼脂条、抗生素、去离子、冰醋酸源!自`751'文"论(文`网[www.751com.cn、溴化乙锭、EDTA、Tris、Na2EDTA·2H2O、SDS、NaOH。以上试剂从上海生工生物科技有限公司购买。

2.1.4 溶液与培养基

（1）LB培养基：胰蛋白胨 10 g, 酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，H2O 1 L,固体培养基添加琼脂粉15 g，混匀，高压灭菌。

（2）50× TAE缓冲液：100 ml烧杯中，加入Tris 2.42 g，EDTA 0.297 g ；加约80 ml蒸馏水，加入转子用磁力搅拌器充分搅拌使其充分让你溶解；再加入0.571 ml的冰醋酸，用NaOH将pH调至8.5，加蒸馏水定容至100 mL，高温高压灭菌121 ℃，20 min。

（3）SolutionI(pH 8.0的GET缓冲液)：50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA，25 mmol/L Tris-HCl。

（4）SolutionII：现配现用，9 ml H2O，1 ml 10% SDS，200 μl 10 N NaOH

（5）SolutionIII(pH 4.8的醋酸钾溶液)：60 ml 5 mol/L醋酸钾溶液，11.5 ml冰醋酸，28.5 ml H2O，混匀。

（6）X-Gal（40 mg/ml，25 ml）：称取0.5 g的X-Gal固体放于大离心管中，加入12.5 ml的二甲基甲酰胺，枪头混合均匀后用1.5 mL离心管小份分装，-20℃保存。

（7）IPTG(24 mg/ml，25 ml)：称取0.6 g的IPTG固体放于大离心管中，加灭菌水溶解，然后定容至25 mL，在超净工作台用滤液器过滤除菌，然后小份分装于1.5 mL离心管中，-20 ℃避光保存