本研究采用ITS-PCR 技术，并结合形态特征和光学显微结构观察方法对浙麦冬进行病原菌的分离鉴定，并进行致病性实验，阐明新病害特征及其发生发展规律，实现对浙江地区药用植物病害的系统认识。研究结果将有助于广大药农简便、快速、准确地诊断浙江省药用植物病害，科学合理地进行病害防治，实现药用植物无公害标准化生产，推动我省药用植物生产的健康持续发展，促进中药材品质的提高。

2  浙麦冬致病真菌的分离与鉴定 源^自·751|文\论]文'网[www.751com.cn

2.1  材料与方法

2.1.1  供试材料

植物材料：感病植株采自浙江磐安中药材种植地，病株表现为枯叶、黑斑、褐斑等症状。现保存于杭州师范大学浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂10 g，蒸馏水定容至1000 ml）[5]。马铃薯葡萄糖液体（PDB）培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水定容至1000 ml）。

试验所用试剂：Taq DNA polymerase购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；PCR产物克隆试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；其余常用化学试剂均由浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室提供。

2.1.2 病原菌的分离鉴定

2.1.2.1  病原菌的分离与纯化

采用平板分离技术对病原菌进行分离纯化。首先用棉花（70%酒精浸泡）擦洗麦冬病变叶片，然后用无菌刀片在病健交界处切取小块叶片（约1.0×1.0 cm左右），置于70%酒精中浸泡30 s，然后用无菌水漂洗3次，每次1 min，最后将小块叶片放在消毒滤纸上，将水分吸干。用灭过菌的镊子将病组织移到PDA平板培养基上，待4-5 d长出菌落后，挑取菌落边缘菌丝纯化，留待后续观察研究。为避免细菌的污染，在纯化过程中可在平板中加入适量的抗生素，抑制细菌生长，然后通过对菌体培养性状及初步的显微形态观察，将病原真菌进行归类、编号及保存[6]。

2.1.2.2 病原菌的形态鉴定

将分离纯化后的菌接种到PDA平板上培养，记录分离菌落培养的大小、形态、颜色、色素分泌、产孢等性状及菌丝孢子形态。

选取PDA培养l周左右的菌株，滴上无菌水，制成临时装片，选取发育成熟的孢子及菌丝，观测其形态、大小，并用数码显微镜进行拍照。

培养性状的观察要点包括： 

大小：以菌落的直径（cm）表示。 

颜色：包括菌落表面和背面的颜色，及色素是否渗入培养基。 

菌落表面的纹饰：如皱纹、辐射沟纹、同心环、整个菌落致密或疏松等。 

菌落的质地：毡状、毯状、绒毛状、棉絮状、粉质状、革质状、有无成束状或绳状的气生菌丝。