1、材料与方法源'自-751;文,论`文'网]www.751com.cn

1、1材料

1、1、1实验材料

该实验以GP和H602为亲本构建的RIL群体为研究对象，共有126种品系的大麦籽粒（其中含有124个子代大麦籽粒和GP、H602两个亲本的大麦籽粒）。

1、1、2实验试剂及制备方法

1）裂解液的制备：取2.7g尿素和0.2g CHAPS溶于3ml的灭菌的去离子水中，进行搅拌使其完全溶解（终体积用灭菌的去离子水定容至5ml)，放置4℃保存备用。使用前加入1M的DTT每65ul/ml。

2）1M的DTT的制备：取1.5425gDTT加入10ml的灭菌的去离子水中，搅拌使其充分溶解，放如棕色试剂瓶中4℃保存备用。

3）工作液的制备：按照BCA Reagent A : BCA Reagent B =100:1的比例混合后来制备成工作液。制备好的工作液可放置4℃保存三天使用。

1、1、3实验仪器及设备

水浴锅，移液枪，酶标仪，离心管，离心机，超声仪，微孔板，天平，药勺。

1、2样品实验方法

1、2、1大麦籽粒样品的前处理

由GP和H602为亲本进行自交而得的子代全体及亲本作为研究对象，成熟后进行采集。采集后进行烘干脱水处理，再剥去外皮表面的壳。再对剥完壳的大麦籽粒进行研磨，获得大麦籽粒粉末，分别编号装袋放置阴凉通风处保存备用。

1、2、2大麦籽粒蛋白质的提取

1）样品制备：称取60mg(±0.03mg)样品粉末加入2ml的离心管中，加入600ul裂解液（加入1M的DTT）后立即充分振荡，振荡5min。每个样品做两个平行。

2）样品超声：将振荡后装有样品的离心管按序插入浮板中加入超声仪中进行超声，超声40min。

3）样品离心：将超声后的样品擦干后按序放入离心机中，进行离心12000rpm，30min。

4）样品提取：将离心后的样品轻轻取出，用移液枪取出上清液放入新的离心管中待用。

1、2、3大麦籽粒蛋白质含量的测定

1）从有样品上清液的离心管中分别取出100ul的待测样品加入微孔板中，每种样品取两个平行进行测定。

2）再在有样品的微孔板中加入100ul的工作液，立即平移晃动混匀（不要晃出），留一空加入蒸馏水代替样品用于调零。

3）将加好样品的加入37℃的水浴锅中恒温反应60min,反应结束后将微孔板取出冷却至室温。

4）将酶标仪的波长设定在562nm处对样品进行测定，用蒸馏水调零，尽量在20分钟内完成所有样品的酶标仪检测，以保证数据的准确度（检测样品时建议同BSA标准品溶液同时进行检测）。

5）检测完成后将个样品溶液的吸光度值减去Blank值的平均值，再根据标准曲线公式计算出检测样品的蛋白质浓度。