细胞色素酶P450基因芯片数据

Fig.1 The data of gene chip for cytochrome p450 

2.材料与方法

2.1材料

用于克隆该酶系的母本为拟南芥基因组DNA，拟南芥种子有本实验室保存。遗传转化的受体植物本生烟（Nicotiana benthamiana）种子由中国农业科学院油料作物研究所提供，用于克隆以及载体构建的各材料均由本实验室购买和保存。

2.2 细胞色素酶启动子的克隆源-自/751+文,论`文'网]www.751com.cn

2.2.1 拟南芥总DNA的提取

以野生型拟南芥幼叶为材料，采用CTAB法提取基因组总DNA[7]。

2.2.2 引物设计

根据细胞色素酶P450基因（Genbank accession number: At1g01600）序列，设计并合成PCR扩增引物：

P1: 5’CGTTATGAGGCTTGCAGCACCGTGA3’ 

P2: 5’CTACGATCGGTAGCTCATAATTGTAACCCAGAGA3’

为了便于PCR产物后期的酶切连接，在引物P1/P2序列中分别加入了不同的酶切位点。

2.2.3 PCR扩增目标片段

在50 μL反应体系中分别加入1 μL拟南芥基因组DNA（50 ng）、5 μL dNTP(2mM)、2 μL MgSO4(25 mM)、1 μL引物（25 μM）和1 μL的KOD Plus高保真DNA聚合酶（1 U）。经94℃变性2min后，94℃30s，64-60℃（每个循环降0.5℃）30s，72℃ 2min15s 8个循环；94℃ 30s，60℃ 30s, 72℃ 2min15s, 25个循环；72℃延伸2min。1％琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物和目的片断大小一致。

2.2.4 PCR产物纯化

在进行基因片段的酶切和连接之前，首先对PCR产物进行分离纯化，该过程使用PCR纯化试剂盒。纯化结束后，将其克隆到中间载体pZero++Amp上，然后转化到感受态大肠杆菌内进行扩繁。

2.2.5 阳性克隆筛选

将转化后的大肠杆菌阳性克隆进行PCR筛选，筛选体系（25µl体系）如下：

10×Taq酶Buffer（含(NH4)2SO4）  2.5µl

MgCl2                          2 mM

dNTP                          0.2 mM

P1/P2引物                     各25pM

Taq酶                          1 U

底物                          菌体2.5µl(OD=0.8)

扩增后电泳检测PCR产物，和目标片段大小一致的克隆为阳性克隆，并将阳性克隆测序，确保功能基因已获得。