农药在环境中的的降解主要有物理、化学和生物三条途径。然而多菌灵很难被水解, 热解和光解等物理方法分解, Fleeker［7］等曾研究过多菌灵的光化学降解，而多菌灵在环境中主要是通过生物降解[8]，因此，分离筛选出能高效降解多菌灵的菌株是解决多菌灵污染环境及环境修复的关键所在。目前，国内外关于多菌灵降解菌的报道很少，分离到的多菌灵降解菌有Nocardioides sp. SG-4G[9]、Rhodococcus erythropolist[10-11]、Rhodococcus qingshengii[10, 12]、Rhodococcus jialingiae[13]、Ralstonia sp. [14]、Bacillus pumilus[15]、Pseudomonas sp. [16]、Trichonderma sp. [17]。

从酶以及基因水平上阐明菌株降解多菌灵的分子机理可为菌株进行稳定性遗传改造及环境修复提供参考。目前国内外仅有一篇有关多菌灵降解基因-酶的报道[9]。Pandey等从多菌灵降解菌株Nocardioides sp. SG-4G中分离纯化出多菌灵水解酶MheI，该水解酶含有242个氨基酸残基，负责催化多菌灵降解第一步反应，即将多菌灵水解成2-氨基苯并咪唑。mheI是根据MheI N末端测序结果从菌株SG-4G中克隆出的相应的基因序列。

本文以多菌灵高效降解菌株djl-10为研究材料，克隆了多菌灵水解酶基因mheII，并构建了该基因的大肠杆菌异源重组表达菌株，表达和纯化了多菌灵水解酶，在此基础之上，初步研究了该酶的特性。本文阐明了菌株djl-10降解多菌灵第一步水解反应在基因和酶水平上的分子机理，丰富了多菌灵降解基因-酶的资源库。

2  材料与方法源[自-751*`论/文'网·www.751com.cn/

2.1  供试菌和试剂

试剂：

多菌灵原药、甲醇(色谱纯)、二氯甲烷（分析纯）、氨苄抗生素、卡那抗生素、蛋白酶K等，研究所需其他溶液见附录2。

供试菌：多菌灵高效降解菌株djl-10， 该菌为本实验室在前期研究中从多菌灵农药废水处理系统的活性污泥中分离获得。

2.2  培养基

LB液体培养液：NaCl 10.00g；蛋白胨 10.00g；酵母粉 5.00g；去离子水 1000mL；pH 7.0～7.2。

LB固体培养基：LB液体培养液，琼脂 1.5%～2%。

无机盐液体培养液：NaCl 1.00g，K2HPO4  1.50g，KH2PO4  0.50g，NH4NO3 1.00g，MgSO4·7H2O 0.20g，去离子水1000mL。

无机盐固体培养基：无机盐液体培养液，琼脂 1.5%～2%。

2.3  研究方法

2.3.1  多菌灵水解酶基因的克隆

通过查阅文献比对分析，将疑似的ORF用PCR 扩增并克隆到T载体上，转化到大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞，并进一步验证其多菌灵水解活性。

菌株总DNA的制备：

采取高盐法提取菌体总DNA：接种菌株至100mL的LB液体培养基中，30℃振荡培养。12000g离心1min收集菌体，加等体积的TE（pH8.0）洗涤并重悬菌体于10mL TE中，加溶菌酶至100μg/mL，37℃水浴至体系澄清。加终浓度2%SDS，加蛋白酶K至100μg/mL，37℃水浴过夜。加入1/3体积饱和NaCl剧烈振荡15秒。等体积酚：氯仿：异戊醇反复抽提，12000 r/min离心10min，至无白色界面。转移收集上清，加0.6倍体积异丙醇沉淀，毛细管捞出絮状沉淀，70%乙醇洗涤沉淀，乙醇挥发后溶于200μL TE（pH8.0）中，保存备用。