2  材料和方法

2.1  从GenBank数据库下载泥鳅核苷酸序列

查询所研究物种的英文名称和拉丁学名。在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中输入拉丁名。搜寻的数据库选择EST。点击“Search”将出现大量搜寻到的序列，点击搜寻结果中“Send to:”后的下拉箭头，打开保存对话框，保存类型选择“File”，保存格式选择“FASTA”，分类按照“Data Modified”，选择好各选项后，点击“Create File”，将生成的文件自己命名，并保存在适当位置。生成的文件中，每条序列都以“>”开头；根据所下载的序列数目，新建若干记事本文件，将每100条序列放入一个“.txt”文件中，便于在软件中查找SSR序列。

2.2  泥鳅微卫星的查找

打开“SSRHunter 1.3”软件，打开一个含有序列的记事本文件，该文件的内容将显示在软件左侧空白区内，以右侧默认设置为搜索条件，点击“SSR位点搜索”，搜索结果将以弹窗的形式出现。复制微卫星重复上下游各150bp（即“搜索结果”）到一个新的word文件中。

2.3  泥鳅引物的设计和整理源]自=751^`论\文"网·www.751com.cn/

打开Priemer Primier 5 软件，点击“File” “New” DNA Sequence，然后将一条序列复制到空白区（Ctrl+V），直接点“OK”即可。序列复制到空白区后，点击“Primer”，会出现一个对话框，然后点击“Search”，又会弹出一个对话框，在对话框中设置“Sense Primer” 介于“1 to 150”，“Anti-sense Primer”介于“200 to 整条序列长度”，设置完成后，点击“OK”，会弹出另外一个对话框，再点“OK”。之后会弹出“Search Results”的对话框，选择“Sense”则下面列表中均为软件设计好的正向引物（蓝色字体）；选择“Anti-sense”时，表中显示的均为反向引物（红色字体）。选中任意一个正向或反向引物，左侧“Primer Premier”窗口中就会显示相应引物的位置和信息。按照引物设计原则，挑选得分最高的上下游引物组合作为最终设计的引物。引物设计好之后，将引物设计的结果截图，与相应DNA序列对应保存，以便后续验证和修改。对于设计的引物可根据物种英文名称、中文拼音或拉丁学名命名，如针对泥鳅设计的第一对微卫星引物可命名为：NQ-1F，NQ-1R（根据拼音）或 MA-1F，MA-1R（根据英文）或Ma-1F，Ma-1R（根据拉丁学名），其中F代表上游引物，R代表下游引物。最后将设计好的所有引物整理成表格[3]。