本研究提取镉胁迫后的东南景天总RNA，构建其全长cDNA文库，然后将整个文库包装到改造后的植物双元表达载体pBI121GB，通过农杆菌介导的植物转化方法侵染拟南芥，获得转基因拟南芥，鉴定转基因阳性植株并克隆插入的cDNA，通过对插入基因的初步生物信息学分析为后续筛选耐镉突变体，获得东南景天耐镉相关基因提供分子资源。

2 材料与方法

2.1实验材料与试剂

2.1.1植物材料

矿山型东南景天：人工气候箱中土培，光照16个小时/黑暗8个小时，温度为25℃。100 umol.L-1CdCl2胁迫处理12h后用于实验。

拟南芥：拟南芥种子均匀播种于1/2MS培养基表面，用保鲜膜封好以保持湿度，4℃春化2天过后22℃光照条件下萌发，待种子萌发且幼苗长出两片子叶后，去掉保鲜膜，将其移入盛满培养土并用营养液浸透的边长大约12 cm的方形培养杯中，每杯载种四棵。植物放置在生长架上，温度保持在18-22℃，不能超过25℃，光照强度为150-300 uE平方米-1秒-1，长日照(16小时光照，8小时黑暗)条件下培养。[8]每两个星期，浇灌稀释的营养液，平时让土壤自然吸水，并适当喷洒农药以防止病虫害的发生。

2.1.2酶和主要试剂 文献综述

主要试剂：总RNA提取用试剂采用invitrogen公司的Trizol；利用Promega公司的 thePolyATtract®mRNA Isolation Kits来分离mRNA；反转录酶PowerScript Reverse Transcriptase选自invitrogen公司；AdvantageTM2 PCR Kit采用Clontech公司；DH5α电击感受态选自TAKARA公司；其它试剂均为国产或进口分析纯。

2.1.3菌株与质粒：

(1) 农杆菌菌株EHA105为中国林科院亚林所林木遗传工程组实验室保存。

(2) 质粒pBI121GB为中国林科院亚林所林木遗传工程组实验室改造保存。

2.1.4培养基

(1) 农杆菌培养基

YEP培养基：在950 ml去离子水中加10 g tryptone、10 g yeast extract、5 g NaCl调pH7.0后定容至1L。

YM培养基: 在950 ml去离子水中加KH2PO4 0.5 g、Mannitol（甘露醇） 10 g、C-Glutamine（C-谷氨酰胺）2 g、NaCl 0.2 g、MgSO4 0.2 g、yeast extract 0.3 g，调pH7.0并加15 gAgar后定容至1 L，120℃灭菌，待降温到65℃以下，加入相应抗生素。

(2) 抗生素

利福平(Rif)贮存液的配置：称取0.5 g Rif，25 ml甲醇溶解，过滤灭菌，分装入无菌小管，-20℃冰冻保存，母液浓度为25 mg.ml-1

卡那霉素(Kana)贮存液的配制：称取1 g Kana，用蒸馏水直接溶解，并定容至20 ml，过滤灭菌，分装入无菌小管，-20℃冰冻保存，母液浓度为50 mg.ml-1

2.2实验方法来.自/751论|文-网www.751com.cn/

2.2.1东南景天全长 cDNA 文库构建

2.2.1.1东南景天全株总RNA抽提

(根据invitrogen公司的Trizol reagent 操作说明书进行)

取1g样品加液氮研磨，加入1 ml的 Trizol，室温放置5分钟；加入200 ul氯仿，用力震荡1分钟，冰浴20分钟；4℃，12000 rpm，离心20 min；从每管中吸取上清至另一1.5 ml eppendorf管，加入等体积-20℃预冷的异丙醇,混匀后-80℃沉淀过夜（沉淀RNA）；4℃，13000 rpm离心20 min后，去上清；加入10 ml于4℃预冷的75%乙醇，洗涤沉淀及离心管壁；4℃，13000 rpm离心5 min，弃上清；加入适量DEPC处理过的水，至完全溶解，进行紫外分析测定；进行DNA酶消化，并紫外分析测定