本实验选取草鱼下脚料作为原料，研究草鱼下脚料水解的最佳工艺条件。本研究采用复合酶水解草鱼下脚料，首先是确定复合酶。采用五种蛋白酶（木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶）水解草鱼下脚料，以氨基态氮含量作为衡量指标筛选出两种水解效果最佳的酶，再复合酶的复配比例。然后根据单因素实验确定反应条件的最优反应区间。最后根据单因素实验结果进行响应曲面实验，确定水解最优反应条件，并对水解液中游离氨基酸组成以及含量进行分析。
1  材料与方法
1．1  材料
1．1．1  材料与试剂
草鱼下脚料购自苜蓿园菜市场；木瓜蛋白酶（65万U/g）、胰蛋白酶（4000U/g）、中性蛋白酶（20万U/g）、碱性蛋白酶（20万U/g）、风蛋白酶（20万U/g）购自广西南宁庞博生物有限公司 ；酚酞、乙醇、氢氧化钠、盐酸、PBS缓冲液、甲醛等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
1．1．2  仪器与设备    
MS-H280-ProLED数显加热型磁力搅拌器  上海汉林实验仪器有限公司
DK-8D型电热恒温水槽                 上海森信实验仪器有限公司
L-8900氨基酸自动分析仪                日本日立公司
JYL-Y3九阳营养破壁料理机             九阳股份有限公司
TDZ5-WS离心机                       长沙湘智离心机仪器有限公司
CP124C先行者精密电子天平             奥豪斯仪器（上海）有限公司
1．2  方法
1．2．1  草鱼下脚料蛋白质水解液的制备
将一定量的草鱼下脚料，与相同质量的水共同加入至料理机中充分匀浆，然后将上述匀浆转移至锥形瓶中，以此为基础加入成比例的水调出相应液料比，用氢氧化钠溶液（或是盐酸溶液）调节至所需的pH，在设定水温条件下保温15min,达到所需温度后，加入所需的蛋白酶酶解4h，酶解结束后沸水浴灭酶12min即为草鱼下脚料蛋白质水解液。
1．2．2  复配蛋白酶的确定    
（1）复配蛋白酶的选择
采用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶为草鱼下脚料水解酶，从选择水解效果最优的两种酶作为复合酶。由于购买蛋白酶的比活比较高，选择酶添加量为0.10g，液料比为2:1。按照1.2.1工艺流程制备草鱼下脚料蛋白质水解液，设定水解温度和pH为不同蛋白酶的理论最适值。分别测定五种蛋白酶水解液在1、2、3、4、5、6h时的氨基态氮含量。五种蛋白酶的最适酶解条件如下表1-1。
表1-1 不同酶解条件
条件    木瓜蛋白酶    胰蛋白酶    风蛋白酶    中性蛋白酶    碱性蛋白酶
酶解温度/℃    55    50    50    55    50
pH    6.5    7.5    7.0    7.5    8.0

（2）复配蛋白酶比例确定
以（1）中试验结果所筛选出的两种水解效果最佳的酶进行复配。以复合酶总添加量为0.10g，两种酶复配比例为4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4，液料比为2:1、酶解温度50℃、pH为7.5，酶解时间4h，。分别测定两种蛋白酶在不同配比下水解液中的氨基态氮含量，水解液中氨基态氮最高组的复配比例即为两种酶的复配比例。相同反应条件：液料比为2:1、酶解温度50℃、pH为7.5，分别以0.10g的单一酶作对照实验，平行组对照为3组。 草鱼下脚料宠物诱食剂的制备工艺研究(2):http://www.751com.cn/shiping/lunwen_23516.html