本试验采取脂肪酶与蛋白酶复配使用的方法，以此来提高牛骨粉的水解率。由于骨粉中含有一定量的脂肪，且有些较大的脂肪粒中包裹着一些蛋白质。所以先用脂肪酶将牛骨粉酶解一段时间，使蛋白质充分裸露后，加入一定量的蛋白酶，使得蛋白酶尽量最大化的酶解牛骨粉中的蛋白质。
单一蛋白酶的作用范围小，水解度不高，所得的酶解产物多为多肽，且分子质量较大。利用不同性质不同水解位点的两种或两种以上酶水解，可以实现对底物的深度水解，同时得到分子质量大小、氨基酸组成有差异的肽片断和理化功能特性有较明显差别的水解产物[20]。本试验采取复合蛋白酶和风蛋白酶复配的方式对底物进行深度水解，同时风蛋白酶又可以去除酶解液中带有苦分子的肽。最终确定酶解的最优工艺，并对酶解液中的游离氨基酸成分进行了研究，为牛骨蛋白水解液制备肉香精提供了理论依据。
试验条件是否为最优主要的判断指标是酶解液的水解度、酶解液中的固形物含量、游离氨基酸的成分等。试验中不论水解度还是固形物含量均做平行试验，取平均值，并算其标准偏差。
3 结果与分析
3.1酶解牛骨粉对不同脂肪酶的选择
本次试验优化猪胰脂肪酶和一鸣脂肪酶，并了解其对酶解牛骨粉过程的影响。固定蛋白酶各条件不变，单因素的变化脂肪酶，根据水解度、固形物含量等的大小，最终确定哪种酶为最佳的脂肪酶。
3.1.1 猪胰脂肪酶各因素对酶解牛骨粉的影响
（1） 猪胰脂肪酶温度的确定
为了确定温度对水解度和酶解液中固形物含量的影响，在温度分别为25℃、35℃、45℃、55℃、65℃，pH7.5，底物浓度为1:8，猪胰脂肪酶添加量为2%的情况下酶解3h，之后加入适量木瓜蛋白酶（温度为60℃，加酶量为1.5%，pH为7），酶解3h后，观察不同温度对猪胰脂肪酶水解脂肪效果的影响，结果见图3.1（origin作图）。
 图3.1 温度对水解度和固形物含量的影响
Fig. 3.1 The impact of the temperature on the degree of hydrolysis and solids content
温度主要是靠影响酶的活性来影响水解度的变化。由图3.1可以看出，温度在35℃附近其水解度最高，并且其标准偏差也较小。固形物含量的变化不是特别明显，且在35℃附近有较低值的固形物含量。因为酶是一种特殊的蛋白质，其发挥催化作用时对温度要求较高。若温度较低时，猪胰脂肪酶不能完全发挥其性能，故不能充分水解脂肪以释放包裹的蛋白质，所以水解度较低。而当超过其合适的温度时，其活性会随着温度的上升而慢慢丧失，以致最后无法水解脂肪，所以高温下得到的水解度相当于只加入木瓜蛋白酶酶解得到的水解度。综合利弊，确定猪胰脂肪酶酶解牛骨粉的最适温度为35℃。
（2）猪胰脂肪酶的酶解时间的确定
为了研究猪胰脂肪酶的酶解时间对水解度和固形物含量的影响，在温度35℃，pH7.5，底物浓度为1:8，酶添加量为2%的情况下分别酶解1、2、3、4、5个小时，之后，加入适量的木瓜蛋白酶（温度为60℃，加酶量为1.5%，pH为7）进行蛋白酶解，3h后观察不同酶解时间对猪胰脂肪酶的水解效果的影响，结果见图3.2（origin作图）。
 图3.2 酶解时间对猪胰脂肪酶的水解度和固形物含量的影响
Fig. 3.2 The impact of the hydrolysis time on the degree of hydrolysis and solids content
当其他条件一定时，酶解反应随着时间的增长而逐渐加深。如图3.2所示，酶解时间为3小时时，固形物含量较低，且水解度最高，偏差较小。
随着水解时间的延长，猪胰脂肪酶与底物作用充分，水解度逐渐增加，当达到3h后水解度变化逐渐下降。随着时间的继续增加，底物浓度减少，从而导致水解速度降低。酶解反应的初速度最快，但随着反应混合物中底物浓度的变小、溶解性肽的逐渐增加，这些反应产物与未水解的牛骨粉对酶产生竞争性结合，使溶解氮产生的速度减缓，即蛋白质分子水解不是均匀的。理论上图的变化应该随着时间的增长而趋于平缓，而实际情况中通常会出现下降趋势，其原因可能是：随着水解时间的增长，底物的损耗增大（包括粘在瓶壁上的底物、酶解过程挥发出来的水分等），导致最后离心出来的酶解液体积偏小，从而影响其水解度。此外，酶也可能因为自降解而失活，使酶自身的活力逐渐衰弱。而且在工厂大批量生产时，若酶解时间过长也十分的不经济，因此，综合利弊得出酶解时间3h为最适酶解条件。 牛骨蛋白酶解工艺研究(4):http://www.751com.cn/shiping/lunwen_2441.html