酶催化生产氨基葡萄糖的初步研究(2)

致谢 14

引言

氨基葡萄糖由葡萄糖的一个羟基被氨基取代形成，分子式为 C6H13O5N 。又称氨基葡糖、葡萄糖胺、葡糖胺，是一种重要的氨基己糖。氨基葡萄糖广泛存在于酵母、真菌、细菌、植物和动物体内，也是糖蛋白和蛋白聚糖的主要组成成分，氨基葡萄糖是关节软骨细胞外基质的成分，参与了关节内硫酸肝素硫、酸角质素、糖胺聚糖和透明质酸等多种分子的结构组成[1]。在医药方面，氨基葡萄糖是软骨组织的主要组成成分，以氨基聚糖聚合物的形式存在，氨基葡萄糖聚合物含量不足，可破坏软骨的完整性，导致骨关节炎[2]。补充外源性的氨基葡萄糖，可以预防和治疗骨性关节炎，而且氨基葡萄对人体没有毒害作用。还具有保护肝脏和稳定膜活动的作用[3]。日本和美国都将其作为食品原料和用于保健食品。陈忻[4]研究表明氨基葡萄糖盐酸盐对食品中常见的21种细菌、霉菌、酵母菌有很好抗菌作用，特别是对细菌，氨基葡萄糖盐酸盐浓度越高，其抑菌作用越强。因此氨基葡萄糖盐酸盐可以成为新型的天然食品防腐剂。

代谢工程菌发酵法[4]，利用代谢工程对细菌的基因改造，构建高产氨基葡萄糖的菌株。由于在发酵过程中，氨基葡萄糖对细菌细胞生长有强烈反馈抑制作用，不能在发酵液中大量积累，因此发酵液中先生成大量的乙酰氨基葡萄糖，再通过一定处理，将乙酰氨基葡萄糖转化成氨基葡萄糖。此方法不受原料的限制，生产周期短，生产强度大，得到的氨基葡萄糖无鱼腥和不会引起过敏反应，不容易污染环境，因此成了目前国内外研究的热点。目前国内生产氨基葡萄糖常用的是甲壳素酸水解法、甲壳素酶解法、霉菌发酵法。甲壳素酸水解法，用高度浓度盐酸把几丁质分解乙酰氨基葡萄糖，再将其去乙酰化成氨基葡萄糖[5]，是目前最主要的方法。但是此方法生产存在很多问题：氨糖受原料的限制，得到的氨糖对人具有致敏作用，在生产过程需要大量消耗的酸碱，葡萄糖环的化学修改，容易污染环境等 [6]。甲壳素酶解法，用甲壳素酶水解甲壳素成氨糖，底物甲壳素不溶于水，从而导致转化时间长，生产强度低，使其在工业应用中有一定的局限性。尽管用含有甲壳素酶的发酵液直接进行转化，也一般需要8天时间才达到75%[7]。霉菌发酵法[8]，利用霉菌发酵，再水解细胞壁，生成氨基葡萄糖，此方法耗时，产量低，生产强度低。

酸水解法是工程菌发酵法提取和精制氨基葡萄糖常用的方法，通过把粗的原料液酸解、浓缩、脱水、析结晶、精制等步骤。因其工艺复杂，消耗大量的酸碱，容易污染环境，需要较多的人力物力，产品纯度低，因此具有很大的局限性[9]。

TDAC是一种脱乙酰酶，并且其基因（tdac）在基因组中已经被测定了，重组 TDAC展示出对N-乙酰壳寡糖(GlcNAc2–5)有脱乙酰酶活性，脱乙酰位点在非还原性的 GlcNAc 的残基显露出独特性[10]。这个酶也能去乙酰化 GlcNAc 单体。在原始微生物中，TDAC脱乙酰酶和分解甲壳素的甲壳素酶(Tk-ChiA)、β-氨基葡萄糖苷外切酶(Tk-GlmA)将甲壳素分解氨糖(图1)。TDAC和 Tk-GlmA 的协调作用使甲壳素降解产生 GlcNAc2 。即 GlcNAc2 上有特殊位点：TDAC酶将其去乙酰化 GlcN-GlcNAc ，然后 Tk-GlmA 再把 GlcN-GlcNAc 水解 GlcN 和 GlcNAc ，随后 TDAC酶的第二步脱乙酰作用把剩余 GlcNA c变成 GlcN。到目前为止，来源于真菌和昆虫的甲壳素去乙酰基酶，来自于根瘤菌的壳寡糖去乙酰酶(NodB)，和细菌的 GlcNAc6P 去乙酰酶都是已知的催化类似去乙酰基酶，都参与 GlcNAc 单体和有联系的糖的去乙酰基作用。甲壳素酶有能力从甲壳素链中随机移走乙酰基团[11]，NodB 参与有节信号的生成，和 TDAC一样，去乙酰基作用于N-乙酰基寡壳糖的非还原性 GlcNAc 残基[12]。然而它们不能作用于 GlcNAc 单体，TDAC能去乙酰基作用于GlcNAc单体和同系物一样，但是不能接受 GlcNAc6P 单体作为底物。此外，TDAC的最初的底物与上面的去乙酰基酶是没有联系的。甲壳素去乙酰基酶和 NodB 属于多糖类去乙酰基家族，GlcNAc6P 去乙酰基酶属于酰胺水解酶家族。显然，TDAC是一种新奇的酶，具有催化性质和区别于其他已知的去乙酰基酶的一级结构。酶催化生产氨基葡萄糖的初步研究(2):http://www.751com.cn/shiping/lunwen_48509.html