现在酶制剂行业已迅速发展成为一个重要的产业，而生淀粉糖化酶作为其中的一种，更是随着近年生物质能源的逐渐兴起，也渐成为研究的热点。在过去的传统发酵过程中，需要利用淀粉等原料时，一般需要经过几步才能将其降解为葡萄糖等能被各种微生物所利用的小分子糖类，而此过程往往需要付出很大的代价，所以近年来很多人开始着重对生淀粉糖化酶的研究。生淀粉糖化酶可以省去高温蒸煮糊化的程序，同时也避免了温度较高而造成的可利用糖的损失。因此对生淀粉糖化酶的研究就具有较好的前景及意义。

本研究的目的是从富含淀粉糖化酶的土壤中寻找产生木薯淀粉糖化酶菌株，从中挑选高产生木薯淀粉糖化酶的菌株并进行深入发酵优化研究，以期扩大工业生产木薯淀粉糖化酶的菌源。

2  材料与方法

2.1  材  料

2.1.1  土  样  

取自淮阴师范学院学苑食堂、杂粮煎饼店。

2.1.2  培养基组成

平板分离培养基：木薯淀粉 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，琼脂 20 g，定容至1 L，pH 7.2～7.4，121℃灭菌20 min。其中可溶性淀粉在105℃下灭菌2 h，然后在65℃下无菌操作加入。

富集培养基：木薯淀粉2 g，蛋白胨1 g，牛肉膏0.5 g，K2HPO4 1 g，NH4NO3  1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，KCl 0.5 g，定容至1L，pH7.2～7.4，121℃灭菌20 min。

种子斜面培养基：NaNO3 0.3 g，K2HPO4 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，KCl 0.05 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，蔗糖 3 g、琼脂粉 1.5 g， pH 5.5~6.0，121℃灭菌20 min。

液体发酵培养基：木薯淀粉3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g。其中木薯淀粉在105℃下干热灭菌2 h，然后在常温下无菌操作加入。

2.1.3  主要仪器设备来.自/751·论|文-网·www.751com.cn/

ES-B-5000型电子天平（上海信衡电子有限公司），高压灭菌锅（诸城市鑫正达机械有限公司），数显恒温水浴锅HH-8（江苏金坛市亿通电子有限公司），台式高速冷冻离心机5810R（艾本德中国有限公司），SBA-40C型生物传感分析仪（上海方畦有限公司）。

2.2  方  法

2.2.1  菌种筛选

富集培养  将采集的每种土样称量5 g，加入20 mL无菌水，震荡制成土壤悬液后静置片刻，取上层液体5 mL加入30 mL富集培养基的三角瓶中，将三角瓶置于30℃，150 r/min摇床震荡培养3 d。

初筛培养  初筛平板培养基121℃灭菌20 min，冷却到60℃，每100 mL加入0.1 g/mL 木薯淀粉（过滤灭菌）10 mL，混匀，趁热倒平板。从富集培养基三角瓶中各取1 mL菌液，用无菌水进行梯度稀释，稀释后取10-5、10-6、10-7三种梯度各200 μL涂布在平板中，30℃恒温培养箱培养3 d后，在365 nm紫外光下观察，产生木薯淀粉糖化酶的菌株周围会出现空白圈，且空白圈越大，糖化酶活力越高。依据培养平板上形成的空白圈大小进行菌种筛选。

初筛培养后，根据初筛平板培养基上菌落周围空白圈的大小，挑取空白圈最大的菌落划线分离纯化。分离出单菌落斜面保存[9]，将纯化后的菌株转接到装有50 mL的种子斜面培养基中，于30℃条件下180 r/min摇床培养24 h，制成种子液，然后按体积比为5%的接种量将液体菌种加入到100 mL的发酵培养基中，30℃，180 r/min摇床发酵72 h，取出，将发酵液4℃，8000 r/min，离心5 min，取上清液测酶活。