菜单
　　

    PCR反应体系：cDNA 2μL，上下游引物各1.5μL，dNTP 2μL，LA TaqDNA聚合酶酶0.5μL，加去离子水至20μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30sec，52℃退火45sec，72℃延伸130sec，32个循环；72℃再延伸10min。取样品4μL进行琼脂糖电泳，观察电泳结果，经柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物。
    1.2.3 质粒pMD18-T与目的片段LysM的连接
    目的基因片段与载体pMD18-T的连接按照pMD18-T载体(TaKaRa)说明书操作。将pMD18-T-LysM克隆载体转化大肠杆菌感受态，按照TransB(DE3) Chemically Competent Cell(北京全式金)说明书操作。涂布转化菌体于含氨苄霉素的LB固体培养基，挑取阳性克隆菌，用含氨苄霉素的LB液体培养基扩大培养。提取质粒送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
    1.2.4 pMD18-T-LysM重组质粒和pGBKT7质粒的双酶切与纯化回收
    提取并纯化pMD18-T-LysM重组载体和pGBKT7载体，限制性内切酶SalⅠ和NdeⅠ处理。双酶切体系：SalⅠ和NdeⅠ各1μL，10×H Buffer 2μL，载体16μL；37℃，1h。取反应液5μL琼脂糖凝胶电泳验证双酶切效果。切胶回收目的片段，-20℃保存。
    1.2.5 目的片段LysM与pGBKT7片段的连接
    连接体系：LysM基因7μL，pGBKT7质粒1μL，T4 DNA Ligase 1μL，10×T4 DNA buffer 1μL，去离子水 1μL；16℃过夜。
    1.2.6 重组载体pGBKT7-LysM的转化与阳性克隆的挑取
    将pGBKT7-LysM重组载体转化感受态细胞。涂布菌体于含卡那霉素的LB固体培养基，挑取阳性克隆菌，用含卡那霉素的LB液体培养基扩大培养并提取质粒。
    1.2.7 重组载体pGBKT7-LysM的电泳分析
        电泳检测重组载体和空载体，分析两者大小。
    1.2.8 重组载体pGBKT7-LysM的PCR鉴定
    分别以重组质粒和空质粒为模板进行PCR反应，所用引物及PCR条件同2.2.1，电泳检测PCR产物。
    1.2.9 双酶切处理重组质粒pGBKT7-LysM检测
        SalⅠ和NdeⅠ双酶切处理重组质粒，条件同2.3.1，电泳检测酶切结果。
    1.2.10 重组载体pGBKT7-LysM的测序鉴定
    以pGBKT7载体的通用引物为测序引物，将重组质粒送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。
    2. 结果与分析
    2.1 拟南芥叶片RNA的提取及目的基因的检测
    如图3所示，用拟南芥叶片材料提取其总RNA，得到质量较高的RNA。以总RNA为模板进行反转录RT-PCR，再以LysM的特异引物进行PCR扩增目的基因，得到如图4所示的一条带，其中1、2为1854bp的LysM的目的片段。
     
    图3 拟南芥叶片总RNA
    图4 LysM PCR产物电泳结果
        注：M：DL 5000 Marker；1、2为LysM PCR产物
    2.2 pMD18-T-LysM重组质粒与pGBKT7载体的双酶切检测
    双酶切反应将目的基因从pMD18-T-LysM重组质粒上切下来，琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，如图5所示双酶切后的pMD18-T-LysM重组载体分为两条带，条带2约1854bp，条带1大于2000bp，切胶回收条带2。双酶切后的线性pGBKT7比环状质粒更靠近加样孔。如图6所示2为环状载体，1为线状载体。切胶回收条带1。
     
    图5 pMD18-T-LysM双酶切
        注：M：DL 5000 Marker；2为1854bp目的片段；1为酶切后的线性T载体
     
    图6 pGBKT7载体的双酶切
        注：M：DL 5000 Marker；2为未经酶切处理的pGBKT7载体；1为双酶切后的pGBKT7载体
    2.3 重组质粒pGBKT7-LysM琼脂糖电泳比较大小检测结果
        目的片段LysM全长为1854bp，空载体为7.3kb，空载体的两个酶切位点之间相差不到30个碱基对，这样相差1800bp左右的两个质粒通过琼脂糖凝胶电泳图可以检测，重组载体要比空载体靠近加样孔。如图7条带1为重组载体，核酸碱基对数大约为7.5 kb显然要比条带2空载体更靠近加样孔。初步说明目的片段构建到pGBKT7载体上。   
  1. 上一篇：库拉索芦荟凝胶汁对废电池胁迫下绿豆保护酶的影响
  2. 下一篇：AHL分子荧光法检测质粒的构建

  1. 水稻和拟南芥BRD结构域非...

  2. 不同钙浓度对野生型拟南芥生长的影响

  3. CAS拟南芥突变体在不同钙浓度下的生理响应

  4. 水稻和拟南芥RIO非典型蛋...

  5. 玉米和拟南芥RIO非典型蛋...

  6. 野生型拟南芥及CAS突变体在低pH下的生理响应

  7. HSF转录因子在模式植物水...

  8. 乳业同业并购式全产业链...

  9. 酸性水汽提装置总汽提塔设计+CAD图纸

  10. 大众媒体对公共政策制定的影响

  11. 当代大学生慈善意识研究+文献综述

  12. java+mysql车辆管理系统的设计+源代码

  13. 中考体育项目与体育教学合理结合的研究

  14. 十二层带中心支撑钢结构...

  15. 杂拟谷盗体内共生菌沃尔...

  16. 电站锅炉暖风器设计任务书

  17. 河岸冲刷和泥沙淤积的监测国内外研究现状

　　

About

751论文网手机版...

主页：http://www.751com.cn

关闭返回