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3 结果与分析 11
3.1 原核表达茶树Cystatin蛋白与纯化 11
3.1.1 原核表达Cystatin蛋白 11
3.1.2 Cystatin蛋白亲和纯化效果 12
3.2 Cystatin抗体的制备与纯化 12
3.2.1 抗原浓度测定 12
3.2.2 免疫小鼠抗血清效价 13
3.2.3 Protein A Resin纯化效果——SDS-PAGE 14
3.2.4 纯化后效价检测 15
4 讨论 16
致谢 16
参考文献 17
附录 19
绪论
半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin简介
蛋白酶抑制剂（protein inhibitor）是一类对蛋白水解酶的催化活性有着明显抑制作用的大分子蛋白或多肽，在动物、植物、微生物体内，蛋白酶抑制剂普遍存在。[1]其可以通过抑制蛋白水解酶活性，间接调节机体内的许多至关重要的生命过程，影响蛋白质折叠、对补体激活、影响血凝、抑制炎症反应、促进细胞基质重建以及抑制肿瘤生长等，其在血管性疾病、寄生虫感染性疾病等治疗中也发挥着重要的作用。[2-7]
Cystatins是半胱氨酸蛋白酶家族，他们有着序列同源性和共同的三级结构（一个α-螺旋位于一个反向平行β-折叠的上方）。[8]Cystatins家族包括：
A. 1型Cystatin存在于细胞内，位于许多细胞类型的细胞溶质中，也存在于一定浓度的体液中。它们是约100个残基的单链多肽，不具有二硫键和碳水化合物侧链。1型Cystatin也被称为Stefins（由Stefan研究所首次发现[9]）。
B. 2型Cystatins主要是胞外分泌的多肽，大部分是酸性的，含有形成两个二硫键的四个保守半胱氨酸残基，可被糖基化和/或磷酸化。它们由19至28个残基的信号肽合成。它们广泛分布于大多数体液中。
C. 3型Cystatins是多结构域蛋白。这类蛋白在哺乳动物中的代表是激肽原。在哺乳动物中有三种不同类型的的激肽原：在多种物种中发现的H-（高分子量）和L-（低分子质量）激肽原和只在老鼠中发现的T-激肽原。
D. 未分类的Cystatins。这类是在一系列生物体中发现的Cystatin-样蛋白：植物营养素，哺乳动物中的胎球蛋白，昆虫Cystatin和眼镜蛇毒液Cystatin。 此外，许多Cystatin-样蛋白没有抑制活性。
绪论图-1 软蜱免疫调节唾液Cystatin晶体结构[8]
半胱氨酸蛋白酶广泛存在于细胞内外，并调节各种细胞内蛋白质周转、免疫反应、骨重塑等重要的生物学功能，同时Cystatin能抑制其活性，它们之间的表达不协调可能会减弱免疫细胞功能致使肿瘤的发生、发展。[10]国内外对Cystatin的研究均比较火热，主要集中在Cystatin与肿瘤相关[10-13]、Cystatin与抗虫[14, 15]、抑菌[16, 17]等方面。另外也有研究发现，Cystatin SN（人体内由CST1基因编码的Cystatin蛋白）促进癌细胞增殖方面起重要作用，其在胰腺癌组织及细胞株高表达，是潜在的检测早期胰腺癌的肿瘤标志物。[18]
茶树Cystatin抗体制备简介
目前，茶树Cystatin的研究基本停留在基因全长被克隆的阶段[19, 20]，茶树Cystatin的研究不足，茶树Cystatin抗体的功能、作用等研究更是匮乏。本实验室发现茶树（Camellia sinensis）和马陆（Prospirobolus joannsi）体内Cystatin序列极其相近，可能具有进化上的保守性，也可能是后天基因漂移进入马陆，这对物种进化研究有一定意义。茶树Cystatin抗体对于本实验室研究基因漂移、抗菌肽、细胞的炎症效应、信号通路具有重要意义。制备高效价的茶树Cystatin抗体对于本实验室的后续研究有重要作用。