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    (4)蛋白质含量测定  考马斯亮蓝法。取活血丹叶片0.5 g,于预冷研钵中加2 mL 蒸馏水研磨,4000 rmp离心20 min,上清液即为提取液。取上清液0.1 mL于离心管中,加入5 mL考马斯亮蓝G-250充分混匀,放置2 min后以蒸馏水代替提取液为对照,在595 nm波长下测定,根据标曲算得样品蛋白质含量。
    标准曲线的制备  取6支10 mL干净具塞试管(编号为1、2、3、4、5、6),依次加入100 ug•mL-1标准蛋白溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,蒸馏水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.0 mL,再加入考马斯亮蓝G-250试剂5.0 mL,加塞混匀后,放置2 min ,在595 nm 波长测定吸光值,以标准蛋白质含量(ug)为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,求得回归方程Y=0.0066x+0.0255,R2=0.9988(n=3)。
    (5)过氧化物酶(POD)活性测定  愈创木酚法。取混合液(0.2mol•L-1  pH 6.0磷酸缓冲液50 mL加30% H2O2 0.028 mL加愈创木酚0.019 mL 混合均匀)3 mL加酶液0.1 mL于470 nm波长下测定吸光值,以煮沸的酶液作为对照,每30 s测定一次,测3 min。
    (6)超氧化物歧化酶(SOD)活性测定  靛蓝四唑(NBT)法。称取活血丹叶片0.5 g,于预冷研钵中加5 mL pH 7.8的50 mmol•L-1 磷酸缓冲液,冰浴研磨,4000 rmp离心10 min,上清液即为酶提取液。取10 mL离心管,加入酶液0.05 mL后再加入0.05 mol•L-1磷酸缓冲液1.5 mL、130 mmol•L-1 Met溶液0.3 mL、750 umol•L-1 NBT 溶液0.3 mL、100 umol•L-1 EDTA-Na2溶液0.3 mL、20 umol•L-1 核黄素0.3 mL、蒸馏水0.25 mL,以磷酸缓冲液代替酶液为对照组。混匀后将对照管置暗处,其他各管于4000 Lx 日光下反应20 min,反应结束后,以不照光的对照管做空白,在560 nm下测定吸光值。
    (7)过氧化氢酶活性测定  高锰酸钾滴定法。称取活血丹叶片0.2 g,于预冷研钵中加3 mL pH 7.8的50 mmol•L-1 磷酸缓冲液,冰浴研磨,4000 rmp离心10 min,上清液即为酶提取液;取0.5 mL酶液,加入4 mL 0.05 mol•L-1 pH 7.0磷酸缓冲液在30℃水浴10 min,以煮沸的酶液为对照;水浴处理后的混合液加入1 mL 50 mmol•L-1 H2O2 反应1 min;再加入2 mL 10% H2SO4 终止反应后用10 mmol•L-1 KMnO4滴定为粉红色。
    (8)丙二醛(MDA)含量测定  分光光度法。称取活血丹叶片0.5 g,于预冷研钵中加5% TCA,冰浴研磨,3000 rmp离心10 min,上清液即为提取液;取上清液2 mL,加0.67%硫代巴比妥酸(TBA)2 mL,混合后在100℃水浴上煮沸30 min,冷却后在3000 r•min-1下离心10 min,分别测定上清液在450 nm、532 nm和600 nm处的吸光度值。
    1.3.3 活血丹活性成分含量测定
    (1)总黄酮含量测定  分光光度法[23]。精密称取活血丹干燥粉末0.1 g于10 mL离心管中,加入6 mL 60%乙醇溶液,超声提取80 min,取出静置使冷却至室温,过滤,取滤液1 mL于25 mL容量瓶中加入8 mL 1.5% AlCl3溶液和4 mL pH5.5的NaAc-HAc缓冲液后用60%乙醇定容,以60%乙醇溶液为空白对照,于420 nm波长下测定。
    标准曲线的制备  精密量取芦丁对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6 mL于25 mL容量瓶中,加入8 mL 1.5%  AlCl3溶液和4 mL pH 5.5的NaAc-HAc缓冲液,并用60%乙醇水溶液定容至刻度,摇匀,静置0.5 h。以60%乙醇溶液为空白对照,于420 nm下进行扫描,并对吸光值和芦丁含量进行回归处理,得到回归方程Y=24.077x+0.0038,R2=0.9996(n=3)。
    (2)醇溶性浸出物含量测定  取活血丹样品粉末2 g于100 mL锥形瓶中,加入55%乙醇50 mL,密塞,称定重量,静置1 h后,连接回流冷凝管,加热至沸腾,并保持微沸1 h。放冷后,取下锥形瓶,密塞,再称定重量,用55%乙醇补足减失的重量,摇匀,过滤,精密量取滤液25 mL,置已干燥至恒重的蒸发皿中,在水浴上蒸干后,于105°C干燥3 h,置干燥器中冷却30 min,迅速精密称定重量。
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