- 上一篇：日粮中色氨酸水平对团头鲂幼鱼生长性能体成分及血清生化指标的影响
- 下一篇：油菜素甾醇对马铃薯块茎形成影响的初步研究
5×Tris-Glycine Buffer（SDS-PAGE电泳缓冲液）：称量Tris15.1 g，Glycine 94g，SDS 5.0 g加入约800 mL去离子水，溶解后，补足水定容至1L，室温保存。
2×SDS loading buffer：将1mol/L Tris-HCl（pH 6.8）1mL，10% SDS 4mL，0.02g溴酚蓝，甘油2mL，250 μL β-巯基乙醇，最后加入去离子水定容至10 mL。
考马斯亮蓝R-250染色液：称取1g考马斯亮蓝R-250，量取250 mL异丙醇，100 mL冰乙酸，加入约650 mL去离子水，搅拌均匀后用滤纸除去颗粒物质，室温储存备用。
考马斯亮蓝染色脱色液：量取冰乙酸100 mL，乙醇100 mL，按1比1混合，加去离子水定容至1L，充分混合后使用。
无K+PBS：19mL0.2mo1/LNaH2PO4和81mL0.2mo1/LNa2HPO4混匀后加入约900mL去离子水，定容到1L。
0.1mol/L NaOH：称取NaOH 0.8g，加入150mL的去离子水中，待其溶解后，定容到200mL常温保存备用。
0.1mol/L HCl：需要在通风橱中配置该试剂，取0.9mL浓盐酸，加入90mL的去离子水中，定容到100mL常温保存备用。
蛋白纯化需要用到的试剂
包涵体Binding Buffer：首先称取 Urea 240 g，NaCl 14.6 g，咪唑 0.68 g，倒入烧杯中，再加入50 mL的无K+PBS，搅拌溶解，最后加去离子水定容至500 mL，用0.22 µm滤膜抽滤，过滤掉其中的细菌和杂质，室温下保存备用。
包涵体Elution Buffer：首先称取 Urea 240 g，NaCl 14.6 g，咪唑17 g，倒入烧杯中，再加入50 mL的无K+PBS，最后加去离子水定容至500 mL，调节pH至7.4，用0.22 µm滤膜抽滤，过滤掉此中的细菌和杂质，室温保存。
上清Binding Buffer：包涵体Binding Buffer不加Urea，其他相同。
上清Elution Buffer：包涵体Elution Buffer不加Urea，其余相同。
1. 1. 4 仪器设备
超净工作台；低速大容量离心机（无锡瑞江离心机厂）；高速大容量低温离心机（Beckman）；立式自动电热压力蒸汽灭菌器；2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL的移液枪（GILSON公司）；两台PCR扩增仪（HYBAID公司）；核酸胶电泳仪（DYY-11B，北京市751一仪器厂）；恒温振荡器，用于摇菌（江苏太仓实验设备厂）；隔水式恒温培养箱，（上海森信实验设备有限公司）；超声破碎仪（南京先欧生物技术公司）；涡旋震荡机；电热恒温水槽（DK-8D，上海森信实验仪器有限公司）；常温离心机和冷冻离心机（Eppendorf）；蛋白胶电泳仪（Bio-Rad）；凝胶成相仪（BIO-RAD）。
1. 2 1A蛋白基因的PCR克隆
根据GenBank中和缓艾美耳球虫1A基因序列，应用Primier 5.0软件进行设计1A基因的扩增引物，设计出来的引物P1和P2的5ˊ端分别含BamHⅠ和NotⅠ的酶切位点。引物送至江苏省琴科生物有限公司合成。
以所得到的反转录产物为模板，对过氧化物酶基因进行扩增。充分混匀后瞬离，于PCR仪上94℃预变性 5min，94℃变性 30s，58℃退火30s， 72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10min，16℃保存1h。取5μL PCR产物用 1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。
1. 3 原核表达载体的构建
提取质粒，测量浓度，计算，分别用BamHⅠ和Not Ⅰ双酶切1A片段和原核表达载体pSmart-I(+)，回收1A基因和pSmart-I(+)载体片段，再次测量浓度，按照公式，计算出目的基因和载体片段的比例，用Ligation Mix连接过夜，第二天将连接产物转化到大肠杆菌BL21（DE3）。
细菌转化的步骤：将前一天的连接产物加入到200μL大肠杆菌 BL21感受态细菌中，切记用移液枪吹吸均匀，如果所用的BL21感受态细菌浓度过高，可以用0.1mol/L的CaCl2溶液稀释后使用。吹吸均匀后将其用封口膜封好，在冰上放置30min。30min后将 EP管移至 42℃水浴，90s 后快速转移至冰浴中，冰浴90s~2min。冰浴取出后，在超净台中加入0.8~1mL不含有抗生素的LB液体培养基，用封口膜包好，放置到37℃恒温摇床（150r/min)培养45~60min。然后放入离心机，以4℃ 5000r/min离心 5min，将离心所得的上清，在超净台中用移液枪弃去800μL ，将剩余的大约200 μL菌液重悬，用移液枪全部打到含有氨苄青霉素的固体培养基上，用酒精灯烧过冷却的玻璃棒均匀涂布菌液至涂干，平板倒置，在37℃恒温培养箱中培养过夜，约12-16h后来观察菌落生长情况，不能时间太久，会使菌落长得过大过密，不方便进行下一步挑菌实验。