2.3.3细胞传代
直接吸出培养液细胞,以100转/min,离心5min,弃去上清,重新加入新鲜培养液,轻轻吹匀分置于其他培养瓶中,使细胞密度在1×105-2×105个/mL,加培养液继续培养。
2.3.4细胞处理
Hep G2细胞生长至对数期即可用于后续实验。为测定细胞毒性和氧化应激损伤,细胞以1×105-4×105个/mL的初始密度接种于96孔板中24h。然后加入外消旋体及其对映异构体染毒24h。不同浓度的测试化合物临用前用无水乙醇稀释,再加入实验培养液配制所需浓度,且保持容积乙醇的体积浓度≤0.1%。以0.1%体积浓度的无水乙醇作为实验的对照组[15]。
2.4细胞活性测定(CCK-8法)
CCK-8法是一种操作简单,灵敏度高,准确性和重复性较好的,检测细胞增殖活性的方法。实验方案如下:
1.在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔),将培养板放在培养箱中预培养24h(37℃,5%);
2.向培养板中加入100μL完全培养基或含有不同浓度受试样品的完全培养基;
3.将培养板在培养箱中孵育一段避光时间24h;
4.向每孔加入10μL的CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡,它会影响OD值的测定);
5.将培养板在培养箱内孵育1-4h;
6.用酶标仪测定在OD450nm波长处的吸光度;
细胞存活率=[(实验组As-空白组Ab)/(对照组Ac-空白组Ab)]×100%
细胞抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%
As:试验孔(含有细胞的培养基,毒性物质 + CCK-8)
Ac:对照组(含有细胞的培养基,没有毒性物质 + CCK-8)
Ab:空白孔(不含细胞和毒性物质的培养基 + CCK-8)
如果暂时不测定打算以后测定的话,可以后每孔中加入10μL0.1M HCl或1%w/vSDS,避光可保存24h。
2.5乳酸脱氢酶(LDH)的释放量的测定
收集对数生长期的Hep G2细胞,以l×105 个/mL的密度接种于培养皿中(5mL)。置培养箱中孵育24h后,换成用10%胎牛血清培养液配制的浓度为100 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、12.5 mg/L的甲基异柳磷外消旋体及其对映体的试剂培养液,对照组加入等量培养液置于培养箱内培养24 h。收取各浓度染毒24 h后的细胞上清液作为待测样品,把样品上清液按照操作表1加样。再用酶标仪测定各孔在440 nm波长处的0D值,每个浓度设置5个平行,重复3次。最后根据以下公式,计算LDH释放量(U/gprot)。
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