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摘要：本研究以重瓣型荷花品种‘春雨’为试材，取花芽分化前和花芽分化中两个时期的复合芽建立两个转录组文库,通过高通量测序， 获得花芽分化前和分化中的转录组。 通过分析差异表达的基因，最终筛选出了 Nn1-Nn8 八个可能参与荷花重瓣化的基因。通过半定量 RT-PCR 验证该八个基因在单瓣型和重瓣型荷花花芽分化过程中的表达情况，结果发现，Nn3(MADS-box 转录因子)只是参与了花发育的过程，并没有参与荷花重瓣化过程，其他七个基因(包括 DEF 基因, SEP 基因，PMADS 2基因, CMB1 基因, MYB44 转录因子)都参与了荷花重瓣化过程，是调控荷花重瓣化的关键基因。38018
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毕业论文关键词：荷花；重瓣化；关键基因；转录组测序；半定量
RT-PCRIdentification and Expression Analysis of the Candidate Genes inRegulating Flower Petal dobling in Nelumbo nucifera
Abstract: The test material is the double flower cultivar in lotus named ‘Chun yu’,took the compound budsthat before the flower buds differentiation and during the flower bud differentiation,created twotranscriptome libraries.Through high-throughput sequencing,obtained two transcriptomes that before andduring flower bud differentiation.By analyzing the differently expressed genes, selected eight genes namedNn1-Nn8, which may be involved in the formation process of double flower cultivar in lotus.Throughsemi-RT-PCR,verified the expression of these eight genes in the process of floral bud differentiation bothin the single flower and double flower cultivar.The result showed that Nn3 （MADS-box transcription factor6）was only involved in the process of flower development, and did not participate in the process of flowerdoubleness in lotus,and the other seven genes(Floral homeotic protein DEFICIENS, SEP3：MADS-boxprotein AGL9 homolog, Floral homeotic protein PMADS 2, Developmental protein SEPALLATA 1, Floralhomeotic protein DEFICIENS, MADS-box protein CMB1, Transcription factor MYB44) were involved inthe process of flower doubleness in lotus, they were the key genes that regulated flower petal doubling inNelumbo nucifera.
Key words: Nelumbo nucifera； Flower doubleness； Key genes； Transcriptome sequencing； Semi-RT-PCR
目 录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 供试材料 2
1.2 取样 2
1.3 总 RNA 提取方法2
1.3.1 物品的处理2
1.3.2 试剂2
1.3.3 RNA 提取步骤2
1.3.4 RNA 检测3
1.4 转录组文库构建及测序分析 3
1.5 调控荷花重瓣化的关键基因的筛选3
1.6 半定量表达分析3
1.6.1 去基因组 DNA 反应3
1.6.2 反转录反应4
1.6.3 半定量 RT-PCR 反应4
2 结果与分析4
2.1 荷花花芽总 RNA 提取结果4
2.2 转录组数据分析5
2.2.1 测序数据过滤5
2.2.2 和参考基因组比对6
2.2.3 新转录本预测及基因表达量分析6
2.2.4 差异表达基因检测7
2.2.5 差异基因的 GO 功能分析和 Pathway 功能分析7
2 . 3 调控荷花重瓣化的关键基因的预测9
2 . 4 花芽分化前后差异基因半定量 RT- PCR 表达分析1 0
2.4.1 引物设计结果10
2.4.2 差异基因表达特征分析10
3 讨论 11
致谢12
参考文献12
引言荷花（Nelumbo nucifera Gaertn.）是莲科莲属多年生水生草本植物，是中国十大名花之一，在我国栽培历史悠久，具有非常深厚的文化内涵，它清新脱俗，深受人们喜爱，是园林造景中水景设计的重要元素，具有很重要的观赏价值。荷花的花单生，两性，按花型可分为单瓣型、复瓣型、重瓣型、重台型、千瓣型，相比单瓣花，具有多层花瓣的重瓣花具有更高的观赏价值，也是观赏植物重要的育种目标。重瓣花大致有751种起源方式：苞片起源、积累起源、雌雄蕊起源、重复起源、花序起源和台阁起源（赵印泉等，2009），荷花的重瓣性主要是由于雄蕊和雌蕊不同程度的瓣化所致，属于雌雄蕊起源。而荷花花芽分化可分为：分化起始期、萼片分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期和雌蕊分化期、花托向上发育期，所以可以推测荷花的重瓣性主要取决于雄蕊分化期、雌蕊分化期内的变化。目前，中外学者对植物花器官发育以及重瓣花形成的分子机理已经做了大量研究，1991 年 Coen 和 Meyerowitz 提出了经典的花器官发育的ABC 模型，指出每轮花器官的决定是 A、B、C 这 3 类器官特征基因不同组合表达的结果，A类基因调控萼片的形成，A类基因和 B 类基因共同调控花瓣的形成，B 类基因和 C 类基因共同调控雄蕊的形成，C 类基因调控心皮的形成（Coen et al.,1991）。2001 年 Theissen 提出了 ABCDE 模型，用于解释各种花器官特性基因调控模式，补充说明了 D 类基因可以调控胚珠的发育，E类基因在每一轮花器官的发育中都起作用， 并且提出四聚体模型解释 ABCE 基因间互作关系(Theissen,2001;Theissen et al.,2001)。花发育的同源异型基因主要分为 4 个亚家族：AP1/FRUITFULL(FUL)-like(A 类 ) 、 AP3/PI-like 或 DEF/GLOBO-SA(GLO)(B 类 ) 、AG-like(C/D类)和 SEPALLATA(SEP)-like(E 类)(刘翔等，2009)，这些基因的变化都可以导致花的发育发生变化， 比如在对拟南芥的研究中发现 ABC 模型中花器官特性基因 （尤其是 B 类和 C 类基因）在重瓣花的形成中扮演重要的角色，它们的突变以及反义或者超表达等都可以导致重瓣花的形成（赵印泉等，2009）。