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    摘要：基因组编辑技术对人工改造植物基因培育优良品种具有重要意义。近几年发现的CRISPR-Cas9系统仅需要短的sgRNA和Cas9核酸酶就可以完成特定靶基因的人工编辑，因其简单和有效性被广泛应用于大多数生物的基因组编辑中。传统的sgRNA和Cas9元件位于不同的载体，共转化效率低，利用Gateway技术和定点突变技术对sgRNA进行改造，将sgRNA和Cas9元件构建到同一个基因表达载体以提高转化效率。结果表明，此种改造CRISPR载体的方法是可行的，为以后对基因的改造提供简单、快捷的途径。39312
    毕业论文关键词：基因组编辑；CRISPR-Cas9；sgRNA; Gateway技术
    Optimization of Monocotyledonous Plants CRISPR Vector
    Abstract: Genome editing plays important roles in gene function analysis and more facility for genome editing through short sgRNA and Cas9 nuclease, its simplicity and effectiveness has been widely used in various organisms. Traditional sgRNA and Cas9 elements carried by different constructors, to increase the cotransformation efficiency, The sgRNA and Cas9 elements were builted into a single expression vector, moreover, Gateway technology and Site-Directed Mutation technology were employed for sgRNA expression cassette modifacation. Experiments show that it is a simple reconstruction strategy for gene.                        
    Key words: Genome editing; CRISPR-Cas9; sgRNA; Gateway technology
    目    录
    摘  要    1
    引言    1
    1.材料与方法    3
    1.1实验材料    3
    1.1.1菌株    3
    1.1.2体质粒载    3
    1.1.2酶和试剂    3
    1.1.2.1酶    3
    1.1.2.2抗生素    4
    1.1.2.3生化试剂    4
    1.2仪器设备    4
    1.3实验方法    4
    1.3.1酶切    4
    1.3.2DNA片段补平    5
    1.3.3大片段去磷酸化    5
    1.3.4乙醇沉淀纯化DNA    5
    1.3.5胶回收    6
    1.3.6连接    7
    1.3.7KOD plus高保真酶PCR反应    7
    1.3.8检测PCR反应    7
    1.3.9Gateway技术    8
    1.3.9.1BP反应    8
    1.3.10大肠杆菌转化    8
    1.3.11质粒提取    8
    2.结果与分析    9
    2.1pWBVec8+Ga-b载体的酶切    9
    2.2载体去磷酸化    10
    2.3载体补平    10
    2.4Cas9质粒的酶切    10
    2.5含有Cas9元件片段的补平    11
    2.6Cas9元件片段与载体的连接    11
    2.7pWBVec8+Ga-b-CRISPR质粒检测    11
    2.8入门载体的构建    12
    3.讨论    13
    参考文献    15
    致谢    17
    单子叶植物CRISPR载体的构建引言
    基因组编辑就是指定点改造基因组，得到预期的生物体基因组序列从而发生遗传改变的技术，主要是进行DNA序列的敲除、插入、定点突变和组合编辑等，从而实现基因功能与调控元件的系统研究[1]。从基因组的角度出发对植物基因进行人工改造从而培育优良品种具有非常重要的意义。由于外源 DNA 与基因组靶基因发生同源重组效率很低，因此对植物基因组进行人工改造就显得异常困难。近年来，人们借用人工改造核酸酶来提高同源重组的效率，从而实现了对基因组的精确、定向的人工改造。目前应用于基因组编辑主要包括巨核酶技术(Meganucleases)、锌指核酸酶(ZFN)、以及TALEN核酸酶，它们已在植物基因工程中已经得到了成功的应用。然而传统基因组编辑技术存在明显不足，例如，ZFN和TALEN对于每一个新的ZFN或TALEN嵌合蛋白质都需要被改造才能识别靶序列，这就使两种基因组编辑系统广泛应用受阻。然而最近发现的CRISPR系统介导的基因组编辑技术只需要一小段引导RNA就能够识别特定的DNA[2]。而且一个新的位点只需要一个新的引导RNA，极大的简化了基因组编辑的过程，扩大了靶位点的选择。CRISPR系统也可以应用于靶向基因突变和基因修正，并且该系统也容易设计，可以实现大片段DNA缺失以及用于复合基因编辑。
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