温郁金SCOT-PCR反应体系优化及遗传多样性分析(2)

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2.3 五个因素的综合优化结果 9

2.4 优化的SCoT-PCR反应体系稳定性和适用性检测 10

2.5 温郁金SCoT多态性水平 11

2.6聚类分析 12

2.7遗传相似系数 13

3讨论 13

3.1 SCoT标记的特点及影响因素 13

3.2 SCoT标记在温郁金中应用的优势 14

3.3 温郁金遗传多样性分析 14

温郁金（Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling）是作为一种姜科姜黄属多年生草本植物，其传统产地为浙江瑞安，浙江著名的八道地药材之一，目前已广泛应用于临床，具有活血止痛、行气解郁、凉血、利胆退黄的功效[1] 。近些年的研究证明，温郁金还具有调节免疫功能、抑制中枢神经、改善血液流变性、抗自由基损伤等作用[2] ，同时温郁金的挥发油、姜黄素类成分具有显著的抗癌活性和保肝等作用[3]。因此研究温郁金的遗传多样性具有重要的意义，建立温郁金分子标记技术及其体系优化是分析温郁金品种遗传多样性分析、系统发育研究、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种研究等的研究基础。

诸如RAPD[4]、ISSR[5]等分子标记在温郁金遗传多样性研究中已经有了初步应用，这些研究为温郁金资源的遗传多样性分析、分子鉴定等研究奠定了一定的基础。但是它们都是传统意义上的随机DNA 分子标记，同时扩增非编码区域，且普遍存在重复性差等缺陷，使得这类分子标记在应用上存在误差，因而限制了它们的应用范围。

2009年，Collard 和Mackill从水稻上开发出了一种新的分子标记，即目标起始密码子多态性标记[6]（Start codon targeted polymorphism，SCoT）。其原理是根据植物基因的ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性来设计单引物，通过扩增产生偏向候选功能基因区，该标记技术有效整合了RAPD和ISSR标记技术的优点，具有操作简单、引物通用性高、低成本、高多态性、遗传信息丰富等优点，同时能够有效产生与性状连锁的标记，作为目的基因标记具有有效跟踪目的性状的优点[7]。目前，已成功在玄参(Figwort Root)[8]、药用菊花(Flos Chrysanthemi)[9] 、草莓（Fragaria × ananassa Duch）[10]、甘蔗（Saccharum）[11]、石蒜（Lycoris radiata (L'Her.) Herb）[12]、铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)[13]等多种植物的遗传多样性分析研究中得到初步应用，而有关SCoT标记技术在温郁金遗传多样性研究中尚未见报道。

本实验研究材料为温郁金及广郁金，实验利用L25(56)正交设计，对PCR的5个影响因素：模板DNA、dNTPs、引物、Taq 酶、Mg2+从5个浓度梯度上对温郁金SCoT-PCR反应体系进行优化，建立温郁金的SCoT-PCR反应体系；优化温郁金的SCoT-PCR反应体系，分析其遗传多样性，旨在将该优化的体系进一步应用于温郁金的品种鉴定和系统分类，以期进一步对温郁金亲缘关系研究及遗传资源道地性保护提供技术支持，为实现最大限度的保存温郁金遗传多样性的策略提供科学依据。

1材料和方法

1.1材料及主要试剂

实验材料为温郁金，采摘自广西和温州，一共五个居群、10个样本。SCoT-PCR反应中所用到的 10 mmol·L-1 dNTPs、20 mmol·L-1 Mg2+、2 U·μL-1 Taq酶、10×PCR buffer (100 mmol·L-1 Tris-HCl，100 mmol·L-1 (NH4)2SO4，100 mmol·L-1 KCl，1% Triton X-100，pH 8.8)、引物（引物序列参考Collard和Mackill等[6]），均订购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，D 15000+2000 Marker和DL 2000 Marker均购自于TIAN GEN公司。