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1.3.6.3 重组质粒的转化 10
2. 结果与分析 10
2.1纤维素酶基因的获得 10
2.1.1 SL16基因组的提取 10
2.1.2 PCR扩增 11
2.1.3 PCR扩增产物的纯化回收 11
2.2 易错PCR条件的优化 12
2.3 质粒载体的制备 12
2.4易错PCR产物与质粒的双酶切 13
3. 结论与讨论 13
参考文献 14
致谢 15
点突变构建纤维素酶突变体库引言
纤维素是是人类非常依赖的一种可再生自然资源，在地球上数量很多，也是一种天然高分子。纤维素酶是是一种起协同作用的多组分复合酶，可以降解纤维素以及从纤维素衍生产物生成葡萄糖。根据其催化反应功能不同这一性质可将其分为内切β-葡聚糖酶，外切β-葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶。真菌产纤维素酶的种属比细菌多。细菌产生的纤维素酶主要是葡聚糖内切酶，最适pH一般为中性至偏碱性，大多数对结晶纤维素没有降解性，且产生的纤维素酶不能分泌到细胞外或培养液中，难以提取。近些年来,碱性纤维素酶和中性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中已成功应用,细菌纤维素酶制剂也已显示出良好的应用前景。降低以木质纤维为原料生产的生物产品以及生物能源的成本，有助于促进工业的持续发展。工业生产中主要通过减少纤维素酶的生产成本，改进纤维素酶性能和提高糖产量这三个方面来降低生物炼制的加工成本。本文就从改进纤维素酶性能这方面入手，主要通过连续易错PCR的实验方法对芽孢杆菌的产纤维素酶基因进行非定向改进获得多个点突变并构建纤维素酶突变体库，为了筛选出一株高产纤维素酶菌株。
1.材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验试材
芽孢杆菌：学校发酵实验室提供；
大肠杆菌：微生物实验室提供。
1.1.2 主要培养基
LB液体培养基：蒸馏水100ml，氯化钠1g，蛋白胨1g，酵母粉0.5g，混匀后倒入100ml锥形瓶中。
LB固体培养基：琼脂粉1.5g，蒸馏水100ml，蛋白胨1g，氯化钠1g，酵母粉0.5g，添加至100ml锥形瓶。
两种培养基灭菌条件：压力：0.1 MPa，温度：121 ℃，时间：30 min。
1.1.3 试剂
（1）电泳缓冲液50*TAE：100mlEDTA(0.5mol/L)，242gTris碱，冰醋酸57.1 ml，充分混匀于容量瓶中再用蒸馏水定容至1000ml，颠倒混匀。
（2）电泳缓冲液1*TAE：从上述（1）的50*TAE电泳缓冲液中取出20 ml再在1000ml蒸馏瓶中加入蒸馏水至刻度线，充分混匀备用。
（3）1%琼脂糖凝胶的制备：称取1g琼脂糖于1000ml丝口玻璃瓶瓶中，加入100ml电泳缓冲液1*TAE，轻轻盖上盖子，在微波中持续加热2分钟，至无沉淀或絮状物出现为止，等晾至微微烫手即可倒入制胶槽中，然后等至凝固完全后取出备用。
（4）Enzymatic Lysis Buffer：2mM Na-EDTA,PH 8.0,1.2% Triton X-100 ,20mM Tris,PH 8.0,121℃灭菌处理20min加入适量的Lysozyme(溶菌酶)其终浓度为20mg/ml充分混匀后放置在-20℃的冰箱中保存。
（5）0.1M氯化钙与氯化镁混合液：称取2.03g氯化镁，1.11g氯化钙，加20ml蒸馏水充分混匀后倒入容量瓶中用水定容至100ml，摇匀备用。