东南景天cDNA耐镉基因的筛选

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摘要：利用镉胁迫后的超积累生态型东南景天作为材料，提取总RNA，通过改良SMART技术合成其全长cDNA,回收750 bp以上片段克隆到植物表达载体pBI121GB中，建成东南景天镉胁迫全长cDNA植物表达文库。对随机挑取的阳性克隆进行PCR鉴定，插入片段多为1000 bp以上，证明所构建的文库达到了用于目的基因分离筛选的要求。将连接有东南景天全长cDNA文库的载体转化农杆菌后，借助于农杆菌介导的拟南芥浸花转化体系，转化野生型拟南芥，获得包括插入片段cDNA的转基因拟南芥。克隆转基因拟南芥所携带的目的基因并进行初步的生物信息学分析，为筛选出东南景天cDNA中镉抗性相关基因提供分子资源。65899

毕业论文关键词：东南景天，cDNA文库，基因筛选

ABSTRACT：After using cadmium hyperaccumulating ecotype of Sedum for the material extracted total RNA, full-length cDNA was synthesized by modified SMART Technologies, recycling more than 750 BP fragment cloned into plant expression vector pBI121GB, and built plants Sedum CD full length cDNA expression library. PCR identification of randomly picked clones,length than 1000 bp were got, demonstrate that the library reached for the construction of target gene screening requirements.after Sedum is connected with full length cDNA library of Agrobacterium transformants, by means of Agrobacterium-mediated dipped flowers in Arabidopsis transformation system, transformed wild-type Arabidopsis thaliana, the transgenic Arabidopsis was obtained including the insertion fragment cDNA. Cloned transgenic Arabidopsis carrying the gene and preliminary bioinformatics analysis, provided molecular resources for the screened genes related to cadmium resistance cDNA in s.alfredii.

Keywords：S. alfredii Hance,cDNA Library,gene screening

1 前言 - 3 -

2 材料与方法 - 5 -

2.1实验材料与试剂 - 5 -

2.1.1植物材料 - 5 -

2.1.2酶和主要试剂 - 5 -

2.1.3菌株与质粒： - 5 -

2.1.4培养基 - 5 -

2.2实验方法 - 6 -

2.2.1东南景天全长 cDNA 文库构建 - 6 -

2.2.2 东南景天全长cDNA过表达文库转化拟南芥 - 9 -

2.2.3 东南景天cDNA中耐镉基因的筛选 - 11 -

3 结果与分析 - 12 -

3.1 mRNA 提取结果分析 - 12 -

3.2 全长 cDNA 合成与分级分离 - 13 -

3.3 文库的转化和鉴定 - 14 -

3.4 拟南芥的遗传转化 - 16 -

3.5 转基因植株的分析 - 17 -

3.5.1 转基因植株的 PCR 鉴定 - 17 -

3.5.2 转基因植株中东南景天耐镉基因的分离与测序 - 18 -

结论 - 18 -

参考文献 - 20 -

致谢 - 21 -

东南景天cDNA耐镉基因的筛选

1 前言

随着工业化进程的加快，我国土壤重金属污染日趋严重。据报道，目前我国受镉、砷、铬、铅等重金属污染的耕地面积达到2000万hm2，约占总耕地面积的1/5，全国每年因重金属污染而导致的粮食减产多达1000多万吨，[1]由此造成的经济损失难以估量。我国南方地区重金属污染尤其是镉污染非常普遍，镉离子具有强植物毒性，会抑制植物的生长甚至使其死亡。Cd是毒性最强的重金属之一。作为一种痕量重金属元素，Cd在未污染土壤中主要来源于其成土的母质，一般情况下其含量较低。但由于大气沉降、采矿、冶炼、工业废物排放、污灌、施用污泥及磷肥等自然及人为因素的影响，加快了Cd进入土壤的速度，而Cd在土壤中又具有稳定、易积累和不易消除的特点，因此土壤环境中的Cd具有长期积累和富集的趋势。[2]随着环境中Cd污染范围的扩大和强度的增加，被生物有机体吸收富集的量也相应增大，既可以直接对植物造成不同程度的生理伤害甚者致死，又可以随着食物链的逐级放大作用使食物链的高级消费者--动物和人类受到危害。摄取过量Cd会引起人类的骨痛病、肾损伤、肠胃不适、心血功能障碍，甚至致癌。如日本在60年代曾发生的痛痛病，便是由于食用被Cd污染了土壤生产的“镉米”所致。[3]近年来，我国河南等地也陆续有类似病症报道。论文网