福林酚法测定羧苄西林钠含量的研究(2)

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1 前言

羧苄西林钠为广谱半合成的抗假单孢菌青霉素[1]，通过抑制细菌细胞壁合成发挥杀菌作用。其对革兰阳性菌有作用但稍弱，作用类似氨苄西林。肠球菌对其不敏感，其又对产酶黄色葡萄球菌无效，但对某些肠杆菌科细菌，如大肠埃希菌、变形杆菌、肠杆菌属、枸橼酸菌属、沙门菌属、志贺菌属等，以及铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、奈瑟菌属等其他革兰阴性菌具有抗菌作用。主要适用于系统性铜绿假单胞菌感染，如败血症、呼吸道感染、腹腔、盆腔感染以及皮肤、软组织感染等，也可用于其他敏感肠杆菌科细菌引起的系统性感染[2]。论文网

羧苄西林钠在医药研究和检测中普遍采用高效液相色谱法（HPLC）来检测其含量，高效液相色谱法是一种现代液相色谱法，其工作原理是利用高压输液泵将不同机型的单一溶液或不同比例的混合溶液、缓冲液等流动相泵入到装有填充剂的色谱柱中，注入的供试品因而被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，然后数据处理装置对各种测量数据进行记录和处理，完成定性定量分析工作。因为高效液相色谱法采用了高压流动相、高效固定相和高灵敏度检测器，所以具有灵敏度高、分析速度快等特点[3]，但是该方法比较昂贵，不适于大量的定量分析。为了能低成本、简单、方便、快速、准确地测定羧苄西林钠的含量，又因为其结构与蛋白质较为类似，都含有肽键，所以决定采用价格低、操作方便、显色灵敏的福林酚比色法，该方法所用的福林酚试剂由试剂A和试剂B两个本分组成，试剂A使羧苄西林钠中的肽键在碱性的条件下与碱性铜试液中的Cu2+作用生成一种复合物，试剂B在该碱性条件下，试剂B中的磷钼酸一磷钨酸被该复合物的残基还原，生成蓝色物质[4]，并增加显色程度。本实验对该方法的主要影响因素、稳定性、重现性、精密度等进行研究，确定了检测羧苄西林钠含量的福林酚比色法。

2 材料与方法

2.1 材料与设备

2.1.1 实验材料与试剂

羧苄西林钠溶液的配制：称取15.0mg的羧苄西林钠，用去离子水加至15mL后，振荡摇匀至完全溶解，配制成浓度为1.0mg/mL的羧苄西林钠溶液。

试剂A1：称取20g无水碳酸钠、2g氢氧化钠溶解于1L的去离子水中。

试剂A2：称取0.2g硫酸铜溶于20mL去离子水中。

试剂A3：称取0.4g酒石酸钾钠溶于20mL的去离子水中。

试剂A（碱性铜试液）的配制[5~6]：在测定当天将试剂A1：试剂A2：试剂A3按100:1:1的体积比混合，并放置30min后使用。

试剂B（福林酚试剂）（上海荔达生物科技有限公司）

2.1.2主要设备

722S可见分光光度计、HH-S恒温水浴锅、天子天平、移液枪（规格：200μL、1000μL）、试管。

2.2 方法

2.2.1 最佳波长的选择[7]

吸取0.1mL 1mg/mL羧苄西林钠溶液于试管中，再加入0.9mL的蒸馏水，然后加入5mL试剂A，室温（15℃）静置10min后，再加入0.5mL试剂B（福林酚显色剂）后立即混匀，室温（15℃）静置30min显色后，将试剂空白作参比，最后在分光光度计下进行从波长400~800nm的全波长测定（每20nm测值）。

2.2.2试剂A最佳温度、时间和用量的确定[8~9]

最佳温度的测定：吸取0.1mL 1mg/mL羧苄西林钠溶液于试管中，再加入0.9mL的蒸馏水，然后加入5mL试剂A，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴锅中水浴10min后取出，然后加入0.5mL福林酚显色剂（试剂B）后立即混匀，室温（15℃）静置30min显色后，将试剂空白作参比，在分光光度计下进行760nm的测定。