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    1 材料与方法1．1 材料
    1．1．1 菌株、质粒和培养条件 猪链球菌 SS2 P1/7 毒力株分离自患脑膜炎病猪，该菌株由本实验室保存，猪链球菌基因缺失株Δrss06 由本实验室构建。XL10 化学感受态细胞购自南京诺唯赞生物科技有限公司。构建重组质粒所用的质粒 pSET4s 由日本动物健康国家研究所 Dr. Daisuke Takamatsu馈赠， 质粒信息详见表1。 本试验中猪链球菌培养于 THB液体或固体培养基中。除将融合片段整合至猪链球菌基因组时为 37℃外，含重组质粒的猪链球菌的培养温度均为28℃。 大肠杆菌培养于 LB 液体或固体培养基中， 培养温度为 37℃。在必要情况下，培养基添加抗生素壮观霉素（Spc）。对于猪链球菌，培养基 Spc 终浓度为100μg/mL；对于大肠杆菌，培养基 Spc 终浓度为50μg/mL。表 1 本试验使用的质粒信息质粒名称 质粒特性 来源pSET4s温度敏感型自杀质粒载体；Spc抗性；共4506bp，有BamHI(2074bp)和EcoRI(2053bp)酶切位点由日本动物健康国家研究所Dr. Daisuke Takamatsu馈赠pSET4s-0057Spc抗性；pSET4s-同源臂-启动子-SSU0057- 2×Flag；启动子统一用rss29启动子，该启动子在THB条件下可稳定表达[8]；同源臂为猪链球菌SSU1329 和SSU1330之间一段序列，根据同源重组技术，使质粒整合到基因组[8]本试验构建pSET4s-0097Spc抗性；pSET4s-同源臂-启动子-SSU0097- 2×Flag；启动子统一用rss29启动子，该启动子在THB条件下可稳定表达[8]；同源臂为猪链球菌SSU1329 和SSU1330之间一段序列，根据同源重组技术，使质粒整合到基因组[8]本试验构建pSET4s-0591Spc抗性；pSET4s-同源臂-启动子-SSU0591- 2×Flag；启动子统一用rss29启动子，该启动子在THB条件下可稳定表达[8]；同源臂为猪链球菌SSU1329 和SSU1330之间一段序列，根据同源重组技术，使质粒整合到基因组[8]本试验构建
    1．1．2 主要试剂和仪器 THB 购自美国 BD 公司；THY 培养基为添加了 5%酵母浸出物的THB；限制性内切酶（EcoRI、BamHI）、T4 连接酶、DNAMarker（Trans 2K Plus、Trans 2K Plus II） 、 PrimeSTAR Premix、 2×Taq PCR MasterMix、 片段回收试剂盒购自 Takara生物工程公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自 Omega 公司；鼠抗 Flag M2单克隆抗体购自 Sigma-Aldrich 公司；751根过氧化物酶（HRP）标记羊抗小鼠 IgG 抗体、HRP 标记羊抗兔IgG 抗体购自 Boster公司； 兔抗 GroEL 多克隆抗体由本实验室制备； Prestained UltraLow Molecular Weight Protein Marker、Western blot 化学显色试剂盒购自 Thermo Scientific公司；抗生素（Spc）以及其他常用分析纯试剂均购自北京鼎国生物技术有限公司。引物合成和测序由南京擎科生物科技有限公司完成。凝胶成像、紫外分光光度计、电击杯、电穿孔仪、SDS-PAGE垂直电泳系统购自 Bio-Rad 公司。
    1．2 方法
    1．2．1 引物设计 根据NCBI数据库中猪链球菌 P1/7 SSU1329与 SSU1330 之间基因间隔区序列，用 Oligo6软件设计同源臂的上下游引物 PU 和 PD，在 PU 5’端添加EcoRI 酶切位点。选取P1/7 sRNA rss29启动子的基因序列，设计上下游引物 promoter-A和promoter-B，promoter-A 5’端添加 PD 的反向互补序列，使同源臂片段和 rss29启动子片段融合。根据 P1/7 SSU0057、SSU0591、SSU0097的基因序列，分别设计特异性引物A 和B，扩增各靶位基因5’UTR 和ORF 片段，上游引物 A5’端添加 promoter-B反向互补序列，使同源臂-rss29 启动子片段和靶位基因片段融合，下游引物B5’端添加 2×Flag标签片段和BamHI酶切位点。引物信息见表 2。2×Flag标签的基因序列为：5’CTACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGATGTCATGATCTTTATAATC 3’。
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