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摘要目的:建立利拉鲁肽(人胰高糖素样肽-1类似物)的外源性DNA残留量的荧光检测方法，用于利拉鲁肽生产过程的质量控制。方法：基于荧光染料能特异性地与双链 DNA 结合的原理，采用 Pico-Green双链 DNA 荧光定量测定试剂盒来测定利拉鲁肽生产工艺过程Ⅴ、工艺过程Ⅶ和成品中的 DNA残留量，为利拉鲁肽生产过程的质量控制提供依据。结果：使用方法学验证从精密度、加样回收率、重复性等方面对荧光法定量检测出来的数据进行计算、分析，结果表明此方法法适用于试验的进行，最终得出批号为 A（Ⅴ）、B（Ⅴ）和C（Ⅴ）的冻干粉DNA 浓度分别为 2.40ppm、7.16ppm 和 3.44ppm，批号为 A（Ⅶ）、B（Ⅶ）和C（Ⅶ）冻干粉DNA 浓度为＜0.625、＜0.625和＜0.625，批号为A、B和 C成品冻干粉 DNA浓度为＜0.625、＜0.625和＜0.625，数值均低于相关限度要求，因此试验过程中所得数据既已通过方法学考察，说明荧光法适用于此次试验产品纯度的检测。结论：该法操作简便、快捷灵敏、特异性强，可成功检测出利拉鲁肽的外源基因残留量，便于试验的进一步分析，并用于产品的质量控制。51093
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毕业论文关键词：利拉鲁肽 外源性DNA 荧光酶标法 方法学验证 质量控制
Detection of Exogenous DNA Residues InHypoglycemic Agents GLP-1
Abstract Objective: to establish liraglutide (glucagon like peptide 1 analogs) residualexogenous DNA fluorescence detection method, for liraglutide production processquality control. Methods: fluorescent dyes can specifically with double stranded DNAbinding principle based on by Pico-Green double stranded DNA with fluorescencequantitative determination kit was used to determine the production process ofliraglutide V, for residual DNA in process and finished VII, liraglutide productionprocess quality control provide the basis. Results: the use of methods validation fromthe precision, recovery, reproducibility of the face detected by fluorescencequantitative data Calculation analysis. The results show that this method applies totest, the result of batch for A (V), B (V) and C (V) lyophilized DNA concentrationwere 2.40ppm, and 3.44ppm 7.16ppm and batch number for A (VII), B (VII) and C(VII) freeze dry powder DNA concentration < 0.625, < 0.625 and < 0.625, batchnumber for a, B and C finished frozen dry powder concentration of DNA was < 0.625,< 0.625 and < 0.625, values are lower than that limit requirements, so data obtainedduring the experiment already through the method of test Observe that fluorescencemethod is suitable for the detection of the test product purity. Conclusion: the methodis simple, fast, sensitive, specificity, successfully detected residue of exogenous geneof liraglutide, for further analysis, and for quality control of products.
Key words:Liraglutide Exogenous DNA Fluorescent labeling methodMethodology validation Quality Control
目录
摘要--I
Abstract--II
目录--III
1.绪论--1
2.材料与方法--1
2.1主要试剂1
2.2受试药品1
2.3 仪器与耗材--2
2.4 方法--2
3.结果与分析--3
3.1标准曲线4
3.2 精密度--4
3.3加样回收率5
3.4 三类样品中DNA 含量测定-- 6
4.结论--7
5.讨论--7
参考文献--9
致谢--9
1.绪论胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide 1 ,GLP-1)是由人胰高血糖素基因编码，并由肠道 L 细胞分泌的一种肽类激素，具有以下生理作用：以葡萄糖依赖方式作用于胰岛β细胞，促进胰岛素基因的转录，增加胰岛素的生物合成和分泌；刺激β细胞的增殖和分化，抑制β细胞凋亡，从而增加胰岛β细胞数量，抑制胰高血糖素的分泌，抑制食欲及摄食，延缓胃内容物排空等。这些功能都有利于降低餐后血糖并使血糖维持在恒定水平【1】。根据重组生物技术产品安全性评价的要求，产品中外源性 DNA残留量的检测是一个重要项目，必须纳入质量标准中进行控制。2015 年版《中国药典》第四部通则中收载了两种外源性 DNA 残留量检测方法：DNA探针杂交法和荧光染色法。在进行外源性 DNA残留量检测时，可根据供试品具体情况选择其中任何一种方法。第一法，DNA 探针杂交法：供试品中的外源性DNA 经变性为单链后吸附于固相膜上， 在一定条件下可与相匹配的单链 DNA 复性而重新结合成为双链 DNA,称为杂交。将特异性单链 DNA 标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链DNA 杂交， 并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含有的阳性DNA 对照后，可测定供试品中外源性DNA 残留量。第二法， 荧光染色法： 应用双链 DNA荧光染料与双链 DNA特异性结合形成复合物，在波长480nm 激发下产生超强荧光信号， 可用荧光酶标仪在波长 520nm处进行检测，源`自*751?文.论~文`网[www.751com.cn在一定的 DNA浓度范围内以及在该荧光染料过量的情况下，荧光强度与DNA浓度成正比，根据供试品的荧光强度，计算供试品中的 DNA残留量【2】。DNA探针杂交法操作周期长，干扰因素多，重复性较差，只能定性不能定量，还需药品生产企业提供宿主菌DNA 为模板，因而局限性大。荧光法操作简便、快捷，且不需宿主DNA 为模板，因而可广泛应用于药物残余外源性 DNA的检测。本研究运用荧光染色法对降糖药GLP-1 中外源性DNA 残留量进行检测，并进行了方法学验证，为利拉鲁肽生产过程的质量控制提供依据【3】。2.材料与方法2.1 主要试剂PicoGreen双链 DNA荧光定量测定试剂盒：GENMED；BSA：国药集团化学试剂有限公司；三氯甲烷：国药集团化学试剂有限公司；Tris 饱和酚：北京索莱宝科技有限公司。