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CNE-2细胞培养 5
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2.2.3 CNE-2的总蛋白的提取及定量 5
2.2.4 细胞外巯基亚硝基化修饰（避光操作） 6
2.2.5 生物素化S-亚硝基化蛋白及蛋白纯化 6
2.2.6 iTRAQ试剂的标记及检测 6
2.2.7 质谱检测 7
2.2.8 数据统计分析 7
2.2.9 生物信息学分析 7
3 结果与分析 8
3.1 S-亚硝基化蛋白纯化后定量及SDS-PAGE电泳结果 8
3.2 差异蛋白的筛选 8
3.3 差异蛋白的GO分析 15
3.4 差异蛋白的PPI相互作用网络图 16
4 讨论 16
参考文献 18
致谢 19
1 引言
一氧化氮(nitric oxide, NO)作为一种自由基性质的气体，可作用于细胞内的靶分子而参与一系列生理和病理条件下的生物过程[1-2]，调节细胞功能和信号事件，如血管扩张、血管通透性、神经信号传递、免疫防御反应等[3-11]。
NO在肿瘤细胞的相关过程起重要作用，包括血管生成、凋亡细胞周期、侵袭和转移[12]。大量研究表明，NO具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。桑建荣等[13]用NO供体SNP处理胃癌SGC-7901细胞，使细胞周期发生变化，抑制细胞生长，加速细胞凋亡。姜辉等[14]用40 mg/L的NO供体硝酸甘油处理人宫颈癌细胞Hela时可造成细胞生长情况改变，形态出现分离、皱缩，并密度下降，诱导其凋亡。刘智勇等[15]利用不同浓度的SNP（NO供体）处理人肝癌细胞HepG2细胞12 h,发现NO可通过上调p-ERK1/2的表达水平诱导HepG2细胞的凋亡。本课题组前期研究表明NO供体GSNO可以诱导CNE-2凋亡。
1994年Stamler[16-17]首先提出了蛋白质巯基亚硝基化修饰的概念，一氧化氮作用蛋白质半胱氨酸巯基-SH生成-SNO，并指出一氧化氮通过蛋白质巯基亚硝基化修饰进行氧化还原信号转导调控，后续的研究不断证实蛋白质的巯基亚硝基化修饰影响其在细胞内的活性和功能。蛋白质巯基亚硝基化修饰是一种一氧化氮相关的氧化还原型可逆修饰，在介导NO细胞信号转导中发挥重要作用。冯金红[18]冯金红采用GSNO对大鼠心肌蛋白进行体外孵育，对蛋白进行纯化分离鉴定后，确定了10种蛋白，其中腺普酸激酶1(AKI)其活性可以被GSNO所抑制，且这种抑制作用可以被DTT逆转，说明S-亚硝基化修饰可能是一种新的AK活性的调节机制；采用大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型，发现参麦方抗心肌缺血/再灌注损伤的作用可能与提高心肌蛋白S-亚硝基化修饰水平有关。高华[19]用300 μM的SNP作用于PC12细胞8h后，发现细胞内大量蛋白发生巯基亚硝基化修饰，其中p65亚基的巯基亚硝基化修饰抑制了NF-kB的转录活性，从而降低炎症反应。蛋白巯基亚硝基化在NO诱导CNE-2凋亡的机制的作用目前尚不明确，本文试图利用生物素转化技术结合iTRAQ定量蛋白组学技术进行相关研究。