口服芦丁后小鼠肝内的药物分布研究(2)

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近年来，国内学者主要针对其工艺、药理作用及药效学研究等方面进行研究。现如今，芦丁提取工艺由原来传统的成本高效率低提取纯度差的提取工艺改变为应用现代科学原理与技术对其取，如冷碱渗漉法[5]、连续萃取法[6]、大孔吸附树脂法[7]等。近期，很多学者发现芦丁具有抗自由基活性和抗脂质过氧化作用，芦丁具有天然的抗氧化作用，可以清除氧气离子，其清除率可达96%以上。文献表示，芦丁对肝脏器官有保护或治疗作用，当肝脏器官受损时，口服芦丁药物可以减少肝脏的损伤，起到防御作用。

在本实验中，我们小组通过模拟芦丁在小鼠体内代谢情况后，通过高效液相色谱法分析不同时间口服芦丁后小鼠肝脏器官内的药代动力学分布，研究其规律，为今后在临床应用上提供数据。

1.材料与方法

1.1主要试剂与仪器

试剂：芦丁标准品、乙腈、生理盐水、水（1％乙酸）

仪器：高效液相色谱仪HPLC（处理器empower 3、型号 waters e2695+2489UV检测器）、超声波清洗仪、抽滤泵、离心机、烘箱、50 mL离心管、1.5 mL离心管、一次性过滤器、剪刀、镊子、注射器、移液枪、匀浆管、电子天平等

动物：小白鼠

1.2 芦丁的来源与保存

产地为西安青藤的芦丁标准品，一般情况下冷藏于冰箱中待用。

1.3高效液相色谱（HPLC）检测分析芦丁的标准曲线

查阅芦丁的相关文献与资料，得到了高效液相色谱仪检测芦丁的实验中，流动相为乙腈（A）-水（0.1％乙酸，B）。因为0-16 min时，乙腈所占比例为12%-20%，16-35 min时，乙腈所占比例为20%-44%，所以我们取乙腈:水的比例为3:7，波长为265 nm。取3 mL的乙腈溶液放入50 mL离心管中，在加入7 mL水（0.1%乙酸）配置有机溶剂。用电子天平称取0.132 g芦丁标准品放入50 mL离心管中，加入13.2 mL配好的溶剂，混合、摇匀，使芦丁标准品完全溶解，配置成10000 ug/mL的芦丁母液。取5个1.5 mL离心管，按顺序编号为1-5号。用移液枪取芦丁标准品母液1 mL，加入到1号1.5 mL离心管中，再从1号1.5 mL离心管取0.1 mL加入2号1.5 mL离心管后，吸取0.9 mL溶剂到2号1.5 mL离心管中，混匀、配置成1000 ug/mL的芦丁溶液；从2号1.5 mL离心管取0.1 mL加入3号1.5 mL离心管后，吸取0.9 mL溶剂到3号1.5 mL离心管中，混匀、配置成100 ug/mL的芦丁溶液；按此方法稀释成5个浓度梯度，相邻浓度梯度浓度相差10倍。1号-5号浓度分别为：10000 ug/mL，1000 ug/mL，100 ug/mL，10 ug/mL，1 ug/mL。从每个离心管中各取100 uL放入进样瓶中，做好标签，用高效液相色谱仪检测出图谱。根据它们之间稀释浓度倍数关系，分析峰值和面积关系。得出在稀释倍数10倍关系下，它们的线性关系为Y=12771X，其中R²值为0.999，成正比关系，满足定量分析的需要。来!自~751论-文|网www.751com.cn

1.4 离体肝脏匀浆液对芦丁的代谢作用

查阅相关文献与资料和观察芦丁不同浓度峰的图形，10 mg/mL、1 mg/mL这两个浓度出峰情况较好，但是小白鼠口服10 mg/mL的芦丁溶液时会出现不良反应，所以最终尝试用1 mg/mL的芦丁溶液做离体实验。

取6只小白鼠，按顺序编号为1-6号，平均分三组，以颈部脱臼方法处死，取其肝脏，称重，肝重分别为1.0 g、1.5 g、1.8 g、1.1 g、1.2 g、1.1 g,以肝：生理盐水为1:1的比例加入等体积的水进行研磨，研磨均匀后，取1 mL倒入1.5 mL离心管中，分别用移液枪取20 uL 1 mg/mL的芦丁溶液加入，记录给药时间，每组给药时间间隔一小时。把1号、2号立即放入离心机中，转速为5000 r/min，温度为4 ℃，时间为10 min。离心结束后，用注射器取上清液，在注射器入口放一次性过滤器进行过滤，过滤后，用移液枪取100 uL过滤液放入1.5 mL离心管，加入400 uL乙腈，编号，放入离心机中离心，条件不变，离心后，取100 uL放入进样瓶中，编号A1、B1。B1。按此方法，给药1 h、2 h后处理剩余小鼠，编号A2、B2、A3、B3，用HPLC检测出图谱。