表达传染性法氏囊病毒VP2和法氏囊素三肽嵌合基因重组火鸡疱疹病毒的构建(3)

1.2 SPF鸡胚和病毒
    9-10日龄SPF鸡胚、火鸡疱疹病毒（Herpesvirus of turkey, HVT）Fc126株都是在南京天邦生物科技有限公司购买的，法氏囊AH1株是在自己实验室里分离保存的。
1.3 BS10-VP2 基因设计、克隆及表达盒的构建
根据注册的 IBDV VP2 序列设计(GenBank NO. AF362747)设计引物，使用RT-PCR的方法从AH1病毒RNA中扩增完整的IBDV VP2基因。引物序列如下：VP2-F1: 5-ATGGCG AACCTGCAAGATCAAAC-3; VP2-R1: 5-GGGAAGCTTCTACTACCTCCTTATGGCCCGGATTATGT CTTTG-3。
本项目采用密码子排列顺序构成BS基因：5'-AAGCATGGC-3’。设计并合成基因片段BS10-F1、BS10-R1。引物序列如下：BS10-F1: 5-GTCGACATGAAGCATGGCAAGCATGGCAAGCATGGCAAGCATGGCAAGCATGGCAAGCATGGCAAG-3; BS10-R1: 5-TTGCAGGTTCGCCATGCCATGCTTGCCATGCTTGCCATGCTTGCCATGCTTGCCA
TGCTTGCCATG-3。以自身为模板，通过退火的方法将其复性成双链，其PCR产物为编码10个BS三肽的cDNA片段，命名为BS10。
    运用SOE法，以引物BS10-F2、VP2-R2串联BS10基因分别与传染性法氏囊病病毒VP2基因，获得BS10-VP2。引物序列如下：BS10-F2: 5-CTAGCTAGCGTCGTCGACATGAAGCAT-3（含NheI酶切位点）; VP2-R2: 5-GGATCCGGGAAGCTTCTACTACC-3（含BamHI酶切位点）PCR产物经纯化后克隆入pMDsimple-19T载体，命名为pMD-BS10-VP2。
    Pec启动子是人工合成，是由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并将其克隆在载体pUC57中。质粒pMD-BS10-VP2和pUC57-Pec分别通过内切酶NheI, BamHI双酶切、连接，构建表达盒pUC57-Pec-BS10-VP2-polyA。
1.4 重组火鸡疱疹病毒转移载的构建
设计火鸡疱疹病毒HVT非必需区，非必需区UL55～LORF4基因的同源臂AB引物，分别为A-F: 5-CGCGGATCCTTCTTCTTCCCGTTAAAAGGATTTAGGG-3（含BamHI酶切位点）; A-R: 5-GCTCTAGAGCGTCGACCGCCGCGGAATTTGTTTAATGTTAGTTTA-3
（含XbaI, SacII酶切位点）；B-F: 5-GCCCGCGGAAGTCGACGGAAGCTTCAATT
ATTTTATTTAATAACATATAGCC-3(含SacII、SalI、HindIII酶切位点); B-R: 5-GCTCTAGAGCCATAAACAGCGACGATCGTCTCCAGGATC-3(含XbaI酶切位点)。
提取HVT感染的鸡胚成纤文细胞（CEF）总DNA，分别以A-F、A-R和B-F、B-R引物扩增同源臂AB，回收左/右同源臂A/B的PCR产物，经过2次克隆接获得含有HVT左/右同源臂A/B的克隆质粒pUAB。以pMD-gpt（本实验室构建保存）为模板，PCR扩增出两侧带有SacII和SalⅠ双酶切位点的gpt表达盒，经SacII和SalⅠ双酶切回收，克隆到pUAB，获得重组病毒转移载体pUAB-gpt。
利用P3、P4为引物，pUC57-Pec-BS10-VP2-polyA为模板，PCR扩增BS10-VP2基因表达盒，并克隆到pUAB-gpt中，获得重组火鸡疱疹病毒转移载体pUAB-Pec-BS10-VP2-gpt。引物序列如下：P3: 5-GCCAAGCTTAGTTATTAATAGTAATC-3(含HindIII酶切位点); P4: 5-GCGTCGACATGGCGAACCTGCAAGATCAAAC-3(含Sal I酶切位点)。
1.5 重组火鸡疱疹病毒的获得
1.5.1 鸡胚成纤文细胞(CEF)的制备
用10日龄的SPF鸡胚，进行消毒，消毒使用5％碘酊，将蛋壳表面都消毒一遍，然后将鸡胚尽量小心的拿出，并且把它放入装有进行无菌处理过的PBS的平皿内。然后用小剪刀小心的将它的头部，四肢和内脏都去除，再用PBS溶液将剩下的组织器官冲洗，直到外表没有血液，然后将其放入小烧杯中。用外科剪将他们全部剪成1-2mm的小碎块，加入适量PBS溶液轻轻的振荡，然后静置一段时间使组织块全部下沉，用吸管将混有红细胞和碎片的上悬液吸取出来，再加入PBS溶液，方法如上进行，重复多次，直至上悬液清澈为止。量取组织量的3-5倍的胰酶溶液，浓度为0.25％，37℃预热一段时间，加入到组织中，然后将其放在37℃温箱，每隔3 min轻轻摇动一次。大约进行10 min左右，将其从温箱中小心的取出，然后我们用吸管加入少量血清，目的是为了终止其消化。最后进行细胞脱落处理，我们将生长液加入其中，然后徐用粗口吸管轻轻的吹打多次，直到我们所需的细胞脱落分散。用4层纱布过滤到另一个烧杯中。将细胞进行计数，我们制备悬液，使用的方法是用生长液配成20万-40万/ ml细胞的溶液，将其分别装到培养瓶中，将培养瓶放到CO2培养箱中，进行37℃培养处理。表达传染性法氏囊病毒VP2和法氏囊素三肽嵌合基因重组火鸡疱疹病毒的构建(3):http://www.751com.cn/yixue/lunwen_22760.html