1.3.3 抗原最佳包被时间的确定
    使用1.3.2确定的最佳抗原包被浓度包被ELISA板，分成3组，包被时间分别是37℃1h、1.5h、2h。按照间接ELISA程序测定，每组做一次平行重复，取平均值，计算P/N值。
1.3.4 最佳封闭时间的确定
    按照1.3.2和1.3.3确定的条件包被酶标版，洗涤后，用5%的脱脂乳200µL/孔进行封闭，分成3组，分别为37℃封闭2h、3h、4℃12h、37℃2h+4℃12h。进行间接ELISA测定，每组做一次平行重复，取平均值，计算各组P/N值，筛选出效果最好的封闭时间。
1.3.5 待检血清最佳作用时间的确定
按照1.3.2、1.3.3、1.3.4确定的条件包被、封闭，将血清加样后37℃分别作用0.5h、1.0h、1.5h和2h，进行间接ELISA测定，每组做一次平行重复，取平均值，计算各组P/N值，选择最佳血清作用时间。
1.3.6  酶标抗体最佳工作浓度的确定
按照已确定好的条件包被、封闭、加样，将酶标抗体SPA分别用PBST按照1：5000、1：10000、1：15000和1：20000进行稀释，100µL/孔，进行间接ELISA测定，每组做一次平行重复，取平均值，计算各组P/N值，选择最佳酶标抗体浓度。
1.3.7  酶标抗体最佳工作时间的确定
按照已确定好的条件包被、封闭、加样、将酶标抗体加入酶标板后，37℃分别作用0.5h、1h、1.5h，进行间接ELISA测定，每组做一次平行重复，取平均值，计算各组P/N值，筛选出效果最好的酶标抗体作用时间。
1.3.8  底物最佳显色时间的选择
按照已确定的条件包被、封闭、加样、加酶标抗体，用PBST洗涤拍干后，加入TMB在37℃显色，作用时间分别是3min、5min、10min，用2mol/L的H2SO4终止反应，读数。每组做一次平行重复，取平均值，计算各组P/N值，筛选出效果最好的底物作用时间。
1.3.9  间接ELISA方法阴阳性临界值的确定
用间接ELISA初筛，Western-blot检测证实的30份阴性血清，按照之前确定的条件进行间接ELISA检测，记录整理实验数据并进行统计学分析。计算出这30份临床阴性血清样品OD450值的平均值（X）和标准差（SD）。根据统计学原理，得出间接ELISA阴阳性判定的临界值。即当OD450≥X+3SD 时，该临床血清样品判为阳性；OD450≤X+2SD 时，该临床血清样品判为阴性，介于两者之间者则该临床血清样品判为可疑。
1.3.10 重复性试验
1.3.10.1 批内重复性试验
    从临床血清中随机抽取4份不同抗体水平的T+Pm阳性血清和4份阴性血清，每份血清重复试验3次，用同一批次表达纯化的PMT蛋白包被酶标版，按照本实验建立优化的间接ELISA方法在相同实验条件下进行检测，收集整理试验数据，统计学分析试验结果，检测批内重复性。 产毒素性多杀性巴氏杆菌感染抗体间接ELISA方法的建立与优化(3):http://www.751com.cn/yixue/lunwen_23508.html