本论文的研究目的是通过CERS2基因的过表达为乳腺癌临床治疗提供解决措施，为治疗乳腺癌提供新思路。

1、材料与方法

1.1 选取合适的细胞株

从上海细胞库中购买需要的细胞株，即MDA-MB-453，MDA-MB-231，Bcap-37。

1.2 实时定量PCR

1.2.1提取总RNA  

(1)使用Trizol试剂提取可以使用的细胞总的RNA,室温，静置5 min；

(2)每个皿中的细胞再加入1 ml Trizol，用刮刀来回刮，3-4次，放到离心管中，搅拌；

(3)按每毫升Trizol加0.2 ml氯仿，晃动15 s，室温，孵育5-10 min；，11,000 g，4 oC，离心15 min；

(4)将无色上清液移至新的离心管中，加等体积的异丙醇混合，上下混匀，用来沉淀其中的RNA，室温孵育10 min，然后离心；

(5)倒掉上清液，用75%的乙醇洗涤RNA沉淀，震荡均匀，离心5 min；

(6)在室温下，干燥沉淀5 min，注意不要让沉淀完全干燥。使用DEPC-ddH2O溶解DNA沉淀；

(6)最后用分光光度计实时定量RNA。源`自·751.文/论:文'网,www.751com.cn

1.2.2 逆转录反应

进行逆转录反应，目的是把RNA逆转录为cDNA。

1.2.3 实时定量PCR反应

    PCR完成后，经电脑自动分析，查看每个基因的情况，计算每个基因的相对表达量，进行分析。

1.3 Western Blot实验

1.3.1 细胞中蛋白提取     

按照实验要求，获取可以正常使用的细胞，用已经预冷的PBS缓冲液洗涤两次，加入适量的含抑制剂的蛋白质抽提试剂，放在冰上裂解细胞30 min。用细胞刮将培养皿上贴壁细胞刮下来，把细胞裂解液转移至离心管中，于4 oC 12,000 rpm离心 15 min，获取上清液，-80 oC的环境下保存。

1.3.2 SDS-PAGE电泳

 (1)SDS-PAGE凝胶配制

SDS-PAGE凝胶可以通过查阅参考文献来进行配制，也可以使用试剂盒进行配制，最后配成12% SDS-聚丙烯酰胺分离胶。

（2）样品处理

快速混匀，然后放入干净的预置玻璃板（Bio-Rad）空隙中，在顶层加入去离子水，防止空气抑制凝胶的聚合，室温放置30 min。待分离胶完全凝固后，用滤纸将剩下液体吸净。配制浓缩胶，混合均匀，立刻加到分离胶上层。加入电泳缓冲液，在各泳道加入等量蛋白样品，用电泳仪进行电泳。