摘 要：本论文利用G-四链体特异结合荧光染料做信号输出，构建了一种非标荧光方法检测核酸内切酶。DNA探针自杂交形成长茎端发夹结构，封闭G-四链体序列。目标内切酶EcoRI酶切识别位点引发核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)的酶切，释放G-四链体，特异性嵌入荧光染料NMM后荧光显著增强，从而实现对EcoRI活性的检测。该方法设计新颖，操作简单，为进一步研究DNA-蛋白质的相互作用提供了参考。关键词：G-四链体；DNA探针；核酸内切酶；核酸外切酶Ⅲ10428
A Label-free DNA Probe for Fluorescence Assay of Endonuclease Activity Based on G-quadruplex
Abstract: In this paper, we construct a label-free fluorescent method for detection of endonuclease activity by taking the specific interaction between G-quadruplex and fluorescent dye as signal readout. The DNA probe can form a hairpin-shaped structure by self-hybridization, and block the formation of G-quadruplex. The cleavage of recognition site by target endonuclease EcoRI will trigger the digestion of exonuclease Ⅲ (ExoⅢ), leading to the release of free G-quadruplex. After interacting with NMM, a sharp increase in fluorescence intensity can be obtained then the detection of endonuclease activity should be realized. The developed method is novel and easy to use, which may be helpful to the interaction research between DNA and protein.
Keywords: G-quadruplex; DNA probe; Endonuclease; Exonuclease
目 录
摘 要 1
引 言 1
1实验部分 3
1.1实验仪器 3
1.2 实验药品和试剂 3
1.3实验步骤 3
2 结果与讨论 4
2.1实验原理与DNA探针设计 4
2.2实验原理验证 5
2.3实验条件考察 6
2.4核酸内切酶活性的检测性能 7
2.5抑制剂对内切酶活性的影响 8
3 结论 8
参考文献 9
致 谢 11
基于G-四链体的非标DNA探针荧光检测核酸内切酶引 言
蛋白-DNA相互作用的研究是至关重要的。许多重要的领域，从生物技术到药理学和生物学都涉及到复制、重组、DNA修复过程、分子克隆和基因分型。由于其扮演的重要角色，DNA-蛋白质相互作用吸引了生化领域研究人员的极大关注。核酸内切酶是核酸酶识别和切割DNA的一个分支序列，具有很高的特异性。事实上，核酸内切酶在现代的发展分子生物学和传统生物学上也被认为是重要的工具，限制性核酸内切酶，其识别和切割DNA序列有非常高的特异性，通常用来作为模型系统中DNA-蛋白质相互作用的机理研究[1]。EcoRI内切酶被广泛选为研究模型限制性内切酶之间的相互作用的物质。迄今为止，人们已报道了多种方法研究DNA—蛋白质的相互作用，如凝胶电泳[2]、酶联免疫吸附测定（ELISA）、32P放射性标记和高效液相色谱[3]（HPLC）等等。这些方法中，有的使用同位素标记，费时又费力，有的需要双标记的DNA探针，成本较高[4]。随着分子生物学和生物技术的迅猛发展,在现有的实验要求下传统的物理化学研究和生物化学研究方法已不能满足其需要。许多分子生物化学家们都在努力寻求建立和发展更为精确的，有效的，即灵敏有快速的鉴定DNA与蛋白质相互作用的方法。比如一些研究出的新方法：核酸适体技术，质朴技术，等离子共振技术，扫描探针显微镜技术，荧光技术还有分子模拟等先进手段应运而生，这些技术在该领域向微观方面进军有着里程碑意义。本文是以检测核酸内切酶为模型来研究DNA与蛋白质相互之间的作用的[5]。 基于G-四链体的非标DNA探针荧光检测核酸内切酶:http://www.751com.cn/huaxue/lunwen_9486.html