超氧阴离子自由基清除率=[(A1-（A2-A3)]／A0 ×100%
式子中：A2为试样平均的吸光度；A1是空白平均的吸光度。
1.4.2牛膝茎叶多糖对羟自由基（•OH）清除活性
取3支干净的10 mL试管，都加入7.5 mmol／L的邻二氮菲（邻菲罗啉）溶液0.2 mL、7.5 mmol／L的硫酸亚铁铵溶液0.2 mL、pH=7.4 Tris-HC1缓冲溶液1.0 mL，2、3号试管中都要加入7.5 mmol／L H2O2 1.0 mL，最后还要再3号试管中加一定量的稀释之后的样品提取溶液。每个试管都用蒸馏水定容到10 mL，试管在37 ℃的水中持续反应1 h。最后用冷水冷却，在波长为508 nm处测定吸光度时，用水作为空白试剂。每个次处理要做三个重复。
羟自由基清除率=（A样品—A损）∕(A未损—A损)×100％
A样品、A未损、A损依次是加入提取溶液之后的羟自由基体系、不加入H2O2及加了H2O2体系的吸光度。
2.结果与分析
2.1不同提取方法对怀牛膝茎叶多糖提取率的影响
实验采用微波辅助提取和热水浸提法提取怀牛膝茎叶中的多糖，并以苯酚硫酸法测定多糖的含量。
 
图2 不同提取方法对怀牛膝茎叶多糖的提取率
实验结果图2表明，热水浸提法对怀牛膝茎叶多糖的提取率较高为193.79 mg/g，微波辅助提取法的提取率为119.59 mg/g。
微波提取的原理[18]是物质吸收微波能，细胞内温度迅速上升，压力超过细胞壁膨胀承受能力使细胞破裂，才能使多糖流出。微波总体时间短，所以细胞破碎率不会太高[19]。而热水提取的温度比较高，总体时间也比较长。所以，提取多糖的效率要比微波辅助提取多糖的效率高。并且热水浸提法成本低，条件温和、易控，不易破坏多糖的立体结构，从而保证其生物活性。
2.2怀牛膝茎叶多糖提取液的抑菌活性
采用滤纸片法研究怀牛膝多糖对大肠杆菌、农杆菌的抑制效果，以抑菌圈的有无和抑菌圈的直径的大小为指标，实验结果见表2。
表2 实验得到的抑菌圈直径（mm）
菌种    微波辅助浸提液    热水提取液
农杆菌    7.13    7.13
大肠杆菌    6.5    7.13
通过观察培养24 h之后的菌体可以发现，培养基上有明显的透明抑菌圈，并且能测量出抑菌圈的直径。因此可以知道怀牛膝提取物对各实验菌均表现出一定的抑制效果。大肠杆菌是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌，是粪便中的主要菌种。尽管大肠杆菌一般生活在人大肠中并不致病，在肠中对合成文生素K起作用。但偶尔侵入到胆囊、阑尾、腹腔或泌尿系统时，可发生炎症。实验证明了怀牛膝提取物对各实验菌有一定的抑制效果，所以怀牛膝提取物可以用于临床作为抗癌、抗放射、抗肝炎、抗衰老、抗菌、抗病毒、抗氧化的药物中。
2.3怀牛膝茎叶多糖提取液的抗氧化活性
本研究采用分光光度法测定其抗自由基活性，其原因可能是多糖分子上具有还原性的半醛酸羟基，可与活性氧发生氧化还原反应[20]所致。测得怀牛膝茎叶多糖不同提取方法提取液的抗氧化活性实验结果如下图3、4。
 
图3 怀牛膝茎叶多糖提取液对超氧阴离子的清除率
 图4 怀牛膝茎叶多糖提取液对羟自由基的清除率
由实验结果图3、4可知，在试验范围内提取的多糖对超氧阴离子（O2-•）和羟自由基（•OH）均有良好的清除效果。微波辅助提取多糖对超氧阴离子自由基的清除率为60.23％，对羟自由基的清除率为42.28％。热水提取多糖对超氧阴离子自由基的清除率为77.38％，对羟自由基的清除率为48.24％。在正常情况下，体内自由基的产生和清除是平衡的，一旦自由基产生过多或抗氧化体系出现故障，体内自由基代谢就会出现失衡，从而导致细胞损伤，引起心脏病、癌症和衰老等严重疾病。此时，外加一些抗氧化剂协助体内文持氧代谢的平衡对于防止疾病的发生和保持机体的健康是十分有益的[21]。由实验结果可知，怀牛膝多糖可作为潜在的具有抗自由基活性的药物。 怀牛膝茎叶多糖研究及生物活性研究(4):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_325.html